本文關鍵詞：宮內(nèi)發(fā)育遲緩（IUGR）豬臍帶動靜脈血Exosome中microRNA轉錄組的鑒定和表達譜分析　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：臍帶血是連接母體與胎兒的紐帶,是胚胎發(fā)育時期能量、營養(yǎng)物和代謝廢棄物的傳輸通道,能滿足胎兒機體生長、發(fā)育以及維持機體的健康狀態(tài)。動物體液中的microRNAs (miRNAs)通常被選擇性地包被在exosome中。Exosome是由多種類型的細胞所分泌的帶膜囊泡,能將大量特異性的miRNAs主動地定向輸送到受體細胞,并調(diào)節(jié)靶基因的表達和受體細胞的功能。本研究中,在利用原子力顯微鏡(Atomic force microscope,AFM)證實豬臍帶血中存在大量exosome的基礎上,構建了具有代表性的同窩出生健康仔豬和IUGR豬的臍帶動脈血和靜脈血exosome small RNA文庫。用高通量測序的方法分析和注解了豬臍帶動脈和靜脈血exosome中的miRNA表達譜,并用熒光定量方法驗證。另外,對在臍靜脈和動脈血中高表達的miRNAs以及IUGR與正常豬差異表達miRNA進行了功能分析。主要結果如下：(1)以超高速離心的方法從豬臍帶血中分離得到含量較豐富的exosome。通過AFM在納米水平觀察到豬臍帶動靜脈血exosome的大小符合正態(tài)分布,臍靜脈血exosome平均寬度在120 nm左右,高度在17 nm左右,臍動脈血exosome平均寬度在130nm,高度在20nm,與前人報道的人唾液和豬乳汁中exosome的大小相近。(2)通過建庫測序,正常豬臍動脈血(ND)和靜脈血(NJ)以及IUGR豬臍動脈血(ID)和靜脈血(IJ)exosome small RNA文庫有效序列分別占到了總reads數(shù)的83.3%、81.9%、67.57%和62.74%。這些有效序列的長度大多在20～24nt之間,這些讀數(shù)的長度是典型的Dicer酶加工產(chǎn)物長度,符合miRNA的基本結構特征。(3)生物信息學分析表明,在4個豬臍帶血exosome small RNA文庫中一共檢測到554種pre-miRNAs和636種成熟miRNAs。其中,在4個文庫鑒定到的保守miRNAs成熟體和前體分別有292個和260個。(4)每個文庫中表達量前10的miRNAs占總量的60%以上。對Top10的miRNAs功能分析發(fā)現(xiàn),臍靜脈血中高表達的miRNAs主要參與紅細胞生成、血管生成和血管疾��；臍動脈血還參與血管發(fā)育、免疫以及細胞因子應答等多個過程。(5)不同文庫間兩兩比較表明,NJ與ND共有122個差異基因p0.001),其中60個在NJ中高表達,62個在ND中高表達；NJ與IJ共有116個差異基因p0.001),其中89個在NJ中高表達,27個在IJ中高表達;ND與ID共有226個差異基因p0.001),其中127個在ND中高表達,99個在ID中高表達。(6)篩選差異miRNAs進行功能富集分析,結果顯示NJ與ND比較,13個上調(diào)基因主要富集在細胞生長、血管形成以及胚胎發(fā)育中等通路,7個下調(diào)基因主要富集對低氧環(huán)境的應答、調(diào)控細胞的凋亡以及信號轉導以及對免疫應答通路；NJ與IJ比較,16個上調(diào)基因主要富集在轉錄調(diào)控活性、細胞增殖、生長通路,5個下調(diào)基因主要富集在細胞形態(tài)發(fā)生、GTP酶調(diào)節(jié)活性通路；ND與ID比較,16個上調(diào)基因主要富集在細胞死亡、凋亡、p53信號通路,5個下調(diào)基因主要富集在負調(diào)控細胞增殖、細胞程序性死亡以及MAPK信號通路中。表明臍帶動靜脈血之間存在功能差異,并推測IUGR豬臍帶血exosome中miRNAs的表達差異與IUGR豬表型的形成有一定的關系。(7)對4個文庫中差異表達的miRNAs聚類分析表明母體子宮內(nèi)環(huán)境通過臍帶血對IUGR豬的影響小于胎兒自身發(fā)育功能障礙。對IUGR豬和正常豬臍帶血exosome中主要差異miRNAs功能分析發(fā)現(xiàn),促進氧氣運輸和調(diào)節(jié)的miRNAs (miR-210、miR-424-3p、miR-27、miR-26a、miR-24、miR-181a、miR-23b、miR-26b、 miR-130b、miR-107)在IJ中表達下調(diào)、抑制氧氣運輸?shù)膍iRNAs (miR-223、 miR-24、miR-138)在IJ中表達上調(diào)；促進血管生成的miRNAs (miR-130a、 miR-200c、miR-150、miR-17～92、miR-126、miR-378、miR-221、 miR-93、 miR-34a)在IJ和ID中表達下調(diào),抑制血管生成的niRNAs (miR-16、miR-34a、miR-222)在IJ和ID中表達上調(diào)；促進免疫系統(tǒng)發(fā)育的miRNAs (miR-181a、miR-150、 miR-155)在IJ和ID中表達下調(diào),而抑制免疫系統(tǒng)發(fā)育的miRNA (miR-146a)在IJ和ID中表達上調(diào)；促進代謝相關的niRNAs (miR-223、miR-210、let-7)在ID中表達上調(diào),相反,抑制這個過程的miRNAs (miR-143、miR-199a-5p)在ID中表達上調(diào)。上述生理過程都是胚胎健康發(fā)育的必要條件,說明臍帶血中的miRNAs參與了胚胎氧氣傳輸、血管形成、免疫系統(tǒng)發(fā)育和能量代謝方面的調(diào)控,這些通路異�？赡苁菍е翴UGR豬形成的重要原因,IUGR的形成受到了宮內(nèi)胚胎發(fā)育過程中臍帶動靜脈血exosome中miRNAs的調(diào)控。上述研究結果為深入研究臍帶血在胚胎系統(tǒng)發(fā)育過程中的重要功能以及IUGR豬的形成機理提供了基礎數(shù)據(jù),證明可以將豬作為人類發(fā)育醫(yī)學和血液疾病研究的模式生物。
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S828

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本文編號：1322018