本文關(guān)鍵詞：人LL-37基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定　出處：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 奶牛 抗菌肽 LL-37 真核表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染 qRT-PCR Wersten Blot

【摘要】：奶牛乳腺生物反應(yīng)器(Mammary Gland Bioreactor)是將外源基因插入到奶牛的乳腺器官中并進(jìn)行特異性表達(dá),生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因奶牛的一項(xiàng)技術(shù)。特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、效率高等優(yōu)點(diǎn)使其在食品藥品、醫(yī)療、工業(yè)生產(chǎn)以及畜牧養(yǎng)殖等行業(yè)具有廣泛的利用價(jià)值。首先,奶牛的乳房是純天然的高效合成蛋白質(zhì)的器官,其優(yōu)秀的滲透屏障功能可以限制外源基因進(jìn)入體循環(huán)中,減少對(duì)轉(zhuǎn)基因奶牛的損傷。其次,奶牛的高泌乳量可以源源不斷地生產(chǎn)人類所需要的藥用蛋白。除此之外,奶牛乳腺生物反應(yīng)器還可以改變牛奶的組成成分,使其更加接近于人乳,具有更高的利用價(jià)值�？咕氖菑V泛存在于人體、動(dòng)物、植物、昆蟲體內(nèi)的一種小分子多肽,是機(jī)體天然免疫的重要組成成分之一。抗菌肽具有廣譜抗菌活性,對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒及腫瘤細(xì)胞均有拮抗作用,并且不易產(chǎn)生耐藥性。隨著青霉素、鏈霉素等傳統(tǒng)抗生素的長(zhǎng)期作用,很多細(xì)菌都產(chǎn)生了明顯的耐藥性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性抗菌肽因其安全、有效的特點(diǎn)引起了諸多學(xué)者的關(guān)注,從而取代傳統(tǒng)抗生素成為抗病原微生物的新武器。hCAP-18(human Cathelicidin Antimicrobial Peptide 18KDa)是目前在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的抗菌肽Cathelicidin家族中的唯一成員,經(jīng)酶解釋放出的C端片段被稱為L(zhǎng)L-37。LL-37因其N端前兩個(gè)氨基酸殘基為亮氨酸(L)并且氨基酸殘基總數(shù)為37而得名,又稱LL-37/hCAP-18�？咕腖L-37在人體中分布廣泛,除具備抗微生物功能外,還具有中和內(nèi)毒素及免疫調(diào)節(jié)等作用,為今后的感染性疾病、免疫性疾病、新型藥物的開發(fā)和臨床治療等方面的研究拓寬思路。因此,本研究以分子生物學(xué)手段為基礎(chǔ),研發(fā)新型藥用蛋白為目標(biāo)開展研究工作。構(gòu)建pcDNA3.1-LL-37真核表達(dá)載體并檢驗(yàn)其在奶牛乳腺上皮細(xì)胞和奶牛胎兒成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況。本研究采用RT-PCR技術(shù),從人的血樣中擴(kuò)增出LL-37基因片段,并將其連接至pcDNA3.1-His-V5(+)載體,經(jīng)Xho I單酶切鑒定以及測(cè)序等方法證實(shí)真核重組質(zhì)粒的正確性。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LL-37轉(zhuǎn)入奶牛乳腺上皮細(xì)胞和奶牛胎兒成纖維細(xì)胞中,經(jīng)G418藥物篩選獲得上述兩種穩(wěn)定的陽(yáng)性細(xì)胞株,并且利用RT-PCR和Western Blot檢測(cè)目的基因在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達(dá)情況。RT-PCR結(jié)果顯示,經(jīng)轉(zhuǎn)染的乳腺上皮細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞均能夠擴(kuò)增出523bp的LL-37基因。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),LL-37mRNA在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)期均有表達(dá),并且兩種細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的表達(dá)量均為最高。通過(guò)SDS-PAGE電泳,均獲得了約17kDa的目的蛋白。結(jié)果表明,LL-37基因成功整合至奶牛乳腺上皮細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞中并能夠正確表達(dá),為構(gòu)建分泌LL-37蛋白的奶牛乳腺生物反應(yīng)器提供相關(guān)理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823;Q78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳昌杰,趙莉;人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定[J];中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志;2004年06期

2 何煒,張朝,章茜,趙國(guó)強(qiáng),董子明;真核表達(dá)載體pcDNA3.1-MAGE-1的構(gòu)建[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年04期

3 彭仕芳;傅蕾;譚德明;侯周華;;人可溶性腫瘤壞死因子受體1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)工程;2007年03期

4 高雪明;李明才;李燕;袁仙麗;高巧艷;;人白介素-37b的基因克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[J];生物技術(shù);2013年04期

5 孟慶文,曹素芳,李媛,金紅,于康震;綠色熒光蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)檢測(cè)[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2000年S1期

6 程蓓,葉大風(fēng),謝幸,陳懷增,呂衛(wèi)國(guó);人白細(xì)胞介素7基因克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2002年03期

7 李慧卿,韓金祥,李騰國(guó);骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定[J];生物技術(shù)通訊;2003年02期

8 吳砂,張昌菊,葉慶,沈關(guān)心;次級(jí)淋巴組織趨化因子真核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白質(zhì)表達(dá)的鑒定[J];華中醫(yī)學(xué)雜志;2004年04期

9 劉娟,孫永濤,李光玉,劉秋平,翟嵩,王福祥;人中性粒細(xì)胞多肽1真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2004年10期

10 張春莉,李景利,杜柏榕,李秋生,有紅霞,李金鳳,朱迅;重組人紅細(xì)胞生成素二聚體不同真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J];中國(guó)生物工程雜志;2005年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 周儀華;王耀晟;何力鵬;鮑曉明;黃曉;程曉曙;;可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1真核表達(dá)載體pEGFP-N1/sflt-1的構(gòu)建及在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)急診醫(yī)學(xué)分會(huì)第十三次全國(guó)急診醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)大會(huì)論文集[C];2010年

2 王懷鵬;蒲小勇;王行環(huán);單志新;高煒城;楊中華;李世林;羅耀雄;徐戰(zhàn)平;;巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定[A];第十五屆全國(guó)泌尿外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年

3 邱明鏈;;真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-hFasL的構(gòu)建及鑒定[A];2012中國(guó)器官移植大會(huì)論文匯編[C];2012年

4 程蓓;葉大風(fēng);謝幸;陳懷增;呂衛(wèi)國(guó);;人白細(xì)胞介素7基因克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建[A];2000全國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2000年

5 吳涓涓;章曉聯(lián);;反義葡萄糖苷酶Ⅰ和分子伴侶鈣聯(lián)蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建[A];湖北省暨武漢市免疫學(xué)會(huì)第八屆學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2003年

6 承海;糜漫天;張乾勇;;ω-3脂肪酸依賴的跨膜型TNFα真核表達(dá)載體的構(gòu)建及抗癌效應(yīng)研究[A];中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2004年

7 田曉濱;孫立;楊述華;;克隆并構(gòu)建人骨形成蛋白-2真核表達(dá)載體[A];2006年貴州省醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2006年

8 張燦;鞠吉雨;馮永堂;李在連;;乙肝病毒反義X基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建[A];山東免疫學(xué)會(huì)、山東微生物學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)、山東省醫(yī)學(xué)會(huì)微生物學(xué)和免疫學(xué)專業(yè)委員會(huì)、山東省醫(yī)藥生物技術(shù)學(xué)會(huì)2001年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2001年

9 林英;鄭建秋;劉平;葛紅巖;侯麗麗;呂鋒;金迪;馬洪梅;付曉玻;;縫隙連接蛋白50真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)眼科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2007年

10 李剛;王平;;人膀胱逼尿肌中腎上腺素能β_2受體基因的克隆及反義真核表達(dá)載體的構(gòu)建[A];全面建設(shè)小康社會(huì)：中國(guó)科技工作者的歷史責(zé)任——中國(guó)科協(xié)2003年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下）[C];2003年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前2條

1 張中橋;可誘導(dǎo)性真核表達(dá)載體構(gòu)建成功[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2004年

2 ;1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 張守純;p16真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)基因的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2004年

2 王小芳;重組腎上腺髓質(zhì)素真核表達(dá)載體的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

3 張?jiān)?SLC34A2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染人肺泡上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2008年

4 杜德偉;丙型肝炎病毒的受體研究——B族Ⅰ型清道夫受體介導(dǎo)HCV入胞作用的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 廖新華;Neuritin轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建與鑒定[D];石河子大學(xué);2015年

2 m景軍;傳染性法氏囊病病毒VP4和VP5蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及對(duì)Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 姜晨霞;mInsB_(15-23)H-2K~d-SCT真核表達(dá)載體對(duì)NOD小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

4 饒小惠;嵌合PXR表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)CYP3A4表達(dá)的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

5 李婷;重組人甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)蛋白19的表達(dá)與初步鑒定[D];河北北方學(xué)院;2016年

6 崔運(yùn)福;靶向Survivin基因miRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響[D];濱州醫(yī)學(xué)院;2015年

7 徐洪龍;人LL-37基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

8 辛莉;CRMP-1-phrGFP II-N真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)突起生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)[D];暨南大學(xué);2007年

9 呂婷婷;pHsa-miR16-shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建、體外轉(zhuǎn)錄及其活性的鑒定[D];華中科技大學(xué);2009年

10 王艷芳;慢性粒細(xì)胞白血病bcr/abl cDNA克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建[D];山西醫(yī)科大學(xué);2006年

，

本文編號(hào)：1320083