本文關(guān)鍵詞：新孢子蟲NcMIC2-like1重組蛋白對小鼠新孢子蟲感染的免疫保護(hù)作用

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【摘要】：新孢子蟲是一種細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲,宿主范圍廣,主要感染牛和犬,可造成懷孕母畜的流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎。對奶牛的危害尤其嚴(yán)重,被認(rèn)為是奶牛流產(chǎn)的主要原因之一[1-2],給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。迄今為止,尚無可以有效治療新孢子蟲病的藥物,所以免疫預(yù)防是目前控制該病的的重要研究方向。本研究以新孢子蟲NcMIC2-like1基因作為疫苗候選分子,并將NcMIC2-like1基因與IL-2基因串聯(lián),利用原核表達(dá)載體pGEX-4T-1表達(dá)重組蛋白。制備的新孢子蟲重組蛋白NcMIC2-like1和NcMIC2-like1-IL-2免疫小鼠后,測定IgG、IgG1、IgG2a、IL-4和IFN-γ的表達(dá)水平。然后對小鼠感染新孢子蟲,通過小鼠的存活率、增重率以及腦組織中蟲體數(shù)量等評價(jià)重組疫苗對新孢子蟲保護(hù)效果。重組質(zhì)粒pGEX-NcMIC2-like1和pGEX-NcMIC2-like1-IL-2的構(gòu)建及表達(dá)擴(kuò)增得到NcMIC2-like1基因和鼠IL-2基因,對二者進(jìn)行克隆和序列比對分析,開放閱讀框分別為1134bp、204bp,NcMIC2-like1序列與GenBank收錄的新孢子蟲Liverpool hypothetical protein(NCLIV_033690)mRNA同源性為100%。鼠IL-2基因核苷酸序列與GenBank收錄的鼠interleukin 2(Il2)mRNA(NM_008366.3)同源性為100%。PCR、酶切及測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-NcMIC2-like1、pGEX-IL-2和pGEX-NcMIC2-like1-IL-2。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,3個蛋白的分子量大小分別約為70KDa、33KDa和74KDa。Western blot鑒定,重組蛋白pGEX-NcMIC2-like1、pGEX-NcMIC2-like1-IL-2能被小鼠的抗新孢子蟲陽性血清特異性識別。重組蛋白NcMIC2-like1和NcMIC2-like1-IL-2抗新孢子蟲免疫保護(hù)效果對pGEX-NcMIC2-like1-IL-2、pGEX-NcMIC2-like1、pGEX-IL-2重組蛋白進(jìn)行了純化,SDS-PAGE電泳分析顯示純化效果較好。重組蛋白免疫小鼠3次后對小鼠血清中IgG及細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,pGEX-NcMIC2-like1-IL-2和pGEX-NcMIC2-like1重組蛋白免疫小鼠后IgG、IgG1和IgG2a均有不同程度提高,同時IL-4和IFN-γ表達(dá)水平也有升高,和佐劑對照組及空白對照組相比差異顯著(P≤0.05),表明這兩種重組蛋白均可以刺激機(jī)體產(chǎn)生Th1/Th2免疫應(yīng)答。攻蟲40天后,pGEX-NcMIC2-like1-IL-2組小鼠的存活率是90%,平均增重率80.8%,均顯著高于對照組(P≤0.05);pGEX-NcMIC2-like1組小鼠的存活率是70%,平均增重率62.5%,均顯著高于對照組(P≤0.05)。提取各組小鼠腦基因組做熒光定量PCR,結(jié)果顯示pGEX-NcMIC2-like1-IL-2組減蟲率為64.7%,pGEX-NcMIC2-like1組減蟲率為61.4%,均顯著高于對照組(P≤0.05)。pGEX-NcMIC2-like1-IL-2和pGEX-NcMIC2-like1重組蛋白對小鼠的新孢子蟲感染有一定的保護(hù)效果,且重組蛋白pGEX-NcMIC2-like1-IL-2的保護(hù)效果優(yōu)于pGEX-NcMIC2-like1。因此,IL-2對重組Nc NcMIC2-like1蛋白的免疫保護(hù)效果有增強(qiáng)作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.723

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本文編號：1299514