本文關鍵詞：siRNA干擾AR基因對梅花鹿鹿茸軟骨細胞生長發(fā)育的研究

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【摘要】：在雄性梅花鹿的生茸期內(nèi),血漿中雌二醇和睪酮的含量會從高峰值同時下降,并在整個生茸期維持較低的水平。說明一定范圍內(nèi)的低水平的雄激素有利于雄鹿的生茸。在赤鹿的鹿茸組織中測定出了AR的轉錄物。而雄激素對鹿茸的生長發(fā)育的調(diào)控作用需要通過與AR特異性結合形成復合物后起作用,AR是由受體基因編碼控制的,如果AR基因發(fā)生變異,一定會影響AR及其復合物的結構和功能,并最終導致其生物學效應的改變,就可能會對鹿茸的生長和發(fā)育產(chǎn)生相應的影響。本研究先通過克隆出梅花鹿鹿茸軟骨細胞AR基因的序列,再以AR為靶基因設計相應的siRNA,應用siRNA干擾技術,并將篩選出的高效的siRNA導入梅花鹿鹿茸軟骨細胞,研究siRNA對軟骨細胞AR蛋白和mRNA的表達,以及對軟骨細胞的增殖、周期和凋亡的影響,探討雄激素及其受體對鹿茸生長的調(diào)控機制。研究的內(nèi)容和結果如下:(1)獲得的梅花鹿AR部分序列長為2346 bp,序列比對分析表明,該序列為梅花鹿AR基因cDNA序列,開放閱讀框部分共編碼781個氨基酸。序列已經(jīng)向Genbank提交,登錄號為KT599413.1.(2)序列比對結果表明AR基因和AR蛋白在梅花鹿與狍子、牛、綿羊間的同源性均較高。與牛(Bos taurus)、綿羊(Ovis aries)、狍子(Capreolus)的核苷酸同源性均為98%;與人(Human)的核苷酸同源性為89%。與牛(Bos taurus)、綿羊(Ovis aries)、狍子(Capreolus)氨基酸序列進行比對同源性均為98%;與人(Homo sapiens)的氨基酸序列同源性為87%.(3)通過RNAiMax轉染軟骨細胞48 h后,RT-PCR方法對比分析siRNA處理組與對照組,mRNA的相對表達量極顯著降低(P0.01),抑制率在70%左右;Western Blot法檢測結果表明處理組的AR蛋白的表達情況顯著降低(P0.05),說明siRNA的干擾效果明顯。(4)AR siRNA對鹿茸軟骨細胞的凋亡影響不顯著。收集的上清檢測結果表明睪酮和雌二醇的激素水平變化不明顯(P0.05);而細胞周期結果顯示試驗組細胞周期阻滯在S期(P0.01),說明siRNA處理細胞能夠顯著的抑制細胞增殖。結果表明,AR在鹿茸的生長過程中有重要的作用。AR siRNA能夠降低AR mRNA和AR蛋白的表達,通過調(diào)控細胞周期S期的比例抑制細胞的增殖,也間接說明雄激素對梅花鹿鹿茸軟骨細胞的生長發(fā)育有促進作用。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S825

【參考文獻】

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本文編號：1285700