本文關(guān)鍵詞：豬核糖核酸酶L抗PRRSV活性及其機(jī)制初步研究

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【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS),俗稱“豬藍(lán)耳病”,屬于一種高度接觸性傳染病,豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是形成該病的病原,該病臨床表現(xiàn)為母豬妊娠期流產(chǎn)、返情、死胎及各年齡段豬不同程度的呼吸道癥狀。豬體感染PRRSV后豬體免疫抑制,先天免疫應(yīng)答障礙,后天獲得性免疫緩慢,造成細(xì)菌或其他病毒的混合感染或繼發(fā)感染。嚴(yán)重阻礙了世界養(yǎng)豬業(yè)的進(jìn)步,制約全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展步伐。RNase L(Ribonuclease L)是由干擾素(IFN)刺激產(chǎn)生的抗病毒蛋白(Antiviral protein, AVP),參與宿主的特異性免疫和非特異性免疫,在機(jī)體的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等過程中起著舉足輕重的作用。激活后的RNase L具有抑制RNA病毒和部分DNA病毒復(fù)制增殖的作用,我們通過研究發(fā)現(xiàn),豬的RNase L (sRNase L)對(duì)PRRSV在宿主內(nèi)的增殖也具有一定的抑制能力,激活后的sRNase L明顯降低了PRRSV的滴度。圍繞sRNase L抗PRRSV活性及其初步機(jī)制的探索,本論文開展了以下幾個(gè)方面的研究：1. sRNase L真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)根據(jù)GenBank中Sus scrofa RNase L基因序列全長(zhǎng)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,上游添加真核表達(dá)增強(qiáng)序列Kozak序列,下游添加HA標(biāo)簽序列；利用Poly (I:C)刺激,從PK-15細(xì)胞(豬腎上皮細(xì)胞)中擴(kuò)增sRNase L基因全長(zhǎng)。全長(zhǎng)目的基因sRNase L和真核表達(dá)載體pXJ41經(jīng)雙酶切后連接構(gòu)建pXJ41-sRNase L真核表達(dá)載體；重組表達(dá)載體經(jīng)雙酶切驗(yàn)證、測(cè)序分析正確后,Western blotting檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,成功構(gòu)建了表達(dá)sRNase L蛋白的真核表達(dá)載體。2. PRRSV病毒量及IFN-β mRNA表達(dá)水平real-time PCR檢測(cè)方法的建立本研究利用PRRSV的N蛋白基因、IFN-β、管家基因GAPDH的基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物,并構(gòu)建含有PRRSV N蛋白基因的重組質(zhì)粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)品,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,定量檢測(cè)PRRSV N蛋白基因的拷貝數(shù)用以衡量PRRSV的病毒量；以2-ΔΔCt為基礎(chǔ)建立了IFN-p的相對(duì)定量檢測(cè)方法。兩種方法具有線性關(guān)系良好、敏感性高的優(yōu)點(diǎn),對(duì)兩種基因的檢測(cè)特異性強(qiáng),擴(kuò)增片段呈現(xiàn)特異、單一的熔解峰；目的基因和內(nèi)參基因片段的擴(kuò)增效率也比較高,因此,可以用來分析PRRSV病毒量及IFN-p mRNA的水平。3. sRNase L抗PRRSV活性及其機(jī)制初步研究RNase L在機(jī)體的抗病毒免疫過程中發(fā)揮著重要的作用,但sRNase L是否同樣具有抗PRRSV的活性尚未確定,本研究探索了2-5A+/-條件下sRNase L不同轉(zhuǎn)染量對(duì)PRRSV增殖的影響。我們發(fā)現(xiàn),sRNase L對(duì)PRRSV的增殖具有一定的抑制能力,經(jīng)過2-5A激活的sRNase L能夠顯著降低PRRSV的滴度。間接免疫熒光也證實(shí)了PRRSV N蛋白的表達(dá)明顯降低,從而確定了sRNase L具有抗PRRSV的活性。進(jìn)一步通過TFN-β mRNA水平、ISRE啟動(dòng)子活性等的檢測(cè)初步探索了其抗病毒機(jī)制,MARC-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染pXJ41-sRNase L后,相對(duì)熒光定量PCR顯示IFN-p mRNA水平得到了明顯的提高,Luciferase試驗(yàn)表明ISRE啟動(dòng)子活性顯著提高,初步探索了sRNase L通過增強(qiáng)Ⅰ型IFN表達(dá)的同時(shí)也增強(qiáng)ISRE的表達(dá)來強(qiáng)化其抗病毒能力的分子機(jī)制,為更進(jìn)一步闡明sRNase L抗PRRSV的機(jī)制以及新型抗病毒制劑的研究開發(fā)奠定了重要的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.28

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1 錢敏,李關(guān)榮,魯成;核糖核酸酶研究進(jìn)展[J];蠶業(yè)科學(xué);2004年02期

2 董安康;徐宏博;陶鳳云;王旭穎;趙偉;;松鼠胰腺型核糖核酸酶A基因的克隆與表達(dá)[J];生物技術(shù)通報(bào);2011年01期

3 何自珍;;蛋白質(zhì)和核酸起源的研究進(jìn)展[J];云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1989年04期

4 李英愛;;印度水牛瘤胃內(nèi)容物細(xì)胞外核酸酶的提取及其特性[J];延邊農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào);1992年01期

5 陸憲輝;赤霉酸對(duì)刺槐實(shí)生苗中核糖核酸酶活力的影響[J];林業(yè)科學(xué)研究;1990年01期

6 聶明建;王國(guó)槐;;植物核糖核酸酶與轉(zhuǎn)基因工程雄性不育系研究進(jìn)展[J];中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào);2006年03期

7 常勝合,舒海燕,童依平,李濱,李振聲;三個(gè)類核糖核酸酶基因在磷饑餓條件下的表達(dá)(英文)[J];作物學(xué)報(bào);2005年09期

8 張恭勤;浙江產(chǎn)中華眼鏡蛇(Naja naja atra)毒核糖核酸酶的研究[J];動(dòng)物學(xué)研究;1981年S1期

9 Agarwala s.c. ,潘一山;番木瓜的錳、銅和鉬營(yíng)養(yǎng)元素[J];福建熱作科技;1992年Z1期

10 王立克,洪法水;鑭離子對(duì)肉牛胰腺核糖核酸酶活性的影響及作用機(jī)制[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2004年01期

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1 戴志鋒;曾力希;刁鑫;何裕建;;不對(duì)稱力對(duì)核糖核酸酶A和淀粉-碘絡(luò)合物穩(wěn)定性的影響[A];第五屆全國(guó)化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2007年

2 彭晶晶;耿信鵬;周燁;侯海云;;變性核糖核酸酶在疏水表面上吸附時(shí)構(gòu)象變化的研究[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第十五屆全國(guó)化學(xué)熱力學(xué)和熱分析學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2010年

3 梅摥彤;，

本文編號(hào)：1267593