本文關(guān)鍵詞：以基因?yàn)榘袠?biāo)的膠體金免疫層析法檢測(cè)牛結(jié)核病

  更多相關(guān)文章： 膠體金 牛分枝桿菌 結(jié)核分枝桿菌 試紙條 條件優(yōu)化

【摘要】：目的:牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis)能引起較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,其病原菌主要為牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis),偶見(jiàn)于結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis),本研究以牛分枝桿菌AF2122/97與結(jié)核分枝桿菌H37RV的基因差異區(qū)為研究對(duì)象,將PCR技術(shù)和膠體金免疫層析法相結(jié)合,建立以基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)的膠體金免疫層析法,并對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化,以區(qū)分牛分枝桿菌及結(jié)核分枝桿菌。方法:選擇牛分枝桿菌特異基因Mb1582、Mb2048c和結(jié)核分枝桿菌特異基因Rv2647、Rv3426作為目的基因進(jìn)行克隆,然后重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行標(biāo)記,在上游引物的5’端標(biāo)記異硫氰酸熒光素,下游引物的5’端標(biāo)記生物素,并分別以克隆完成的該基因質(zhì)粒、牛分枝桿菌基因組、結(jié)核分枝桿菌基因組、水為模板進(jìn)行PCR,以檢測(cè)引物的特異性。之后完成膠體金免疫層析試紙條的組裝,以檸檬酸三鈉還原法制備膠體金,并確定膠體金與鏈霉親和素偶聯(lián)的最佳條件。金標(biāo)鏈霉親和素稀釋液分別選擇5%蔗糖、5%蔗糖+TritonX-100、5%蔗糖+TritonX-100+0.1%BSA、5%蔗糖+TritonX-100+1%BSA、5%蔗糖+TritonX-100+2%BSA,觀測(cè)膠體金的穩(wěn)定性及釋放情況。選擇流速較慢的硝酸纖維素膜,并將檢測(cè)線兔抗異硫氰酸熒光素抗體濃度稀釋為0.40mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL、1.00mg/mL及1.20mg/mL,質(zhì)控線生物素濃度稀釋為2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5 mg/mL及6 mg/m L、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL,將其分別劃線于硝酸纖維素膜上,觀測(cè)使檢測(cè)線及質(zhì)控線顯色的最低濃度,該濃度即為膠體金試紙條的最佳標(biāo)記濃度。用PBS、TBS、PBS+0.1%BSA、TBS+0.1%BSA作為樣品稀釋液,觀察檢測(cè)結(jié)果。完成膠體金免疫層析試紙條的組裝后,將基因組分別稀釋100-107倍,觀測(cè)使試紙條顯色的最低濃度,并與瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果相比較。將標(biāo)記的上下游引物和未標(biāo)記的上下游引物組合,形成全抗原、半抗原及非抗原反應(yīng),檢測(cè)試紙條顯色情況。以常見(jiàn)病原菌的基因組為模板,檢測(cè)膠體金免疫層析試紙條的特異性。結(jié)果:成功克隆Mb1582、Mb2048c、Rv2647、Rv3426基因;成功提取牛分枝桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌的基因組DNA;成功制備膠體金溶液;膠體金標(biāo)記標(biāo)鏈霉親和素的最佳條件為PH8.5,每毫升膠體金溶液標(biāo)記4.4μg鏈霉親和素;金標(biāo)鏈霉親和素稀釋液選用5%蔗糖+TritonX-100;檢測(cè)線兔抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體的標(biāo)記濃度為1mg/mL,質(zhì)控線生物素的標(biāo)記濃度為7mg/mL;樣品稀釋液為TBS+0.1%BSA;膠體金免疫層析試紙條的最低檢測(cè)級(jí)別為10-3ng/μL的基因組濃度,比瓊脂糖凝膠電泳的靈敏度高100倍;膠體金免疫層析試紙條特異性較好,以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅鋁假單胞菌、沙門氏菌基因組為模板時(shí)均為陰性結(jié)果;膠體金免疫層析試紙條的抗原-半抗原檢測(cè)特異性較好。結(jié)論:成功組裝膠體金免疫層析試紙條,并優(yōu)化試紙條的最佳檢測(cè)條件。結(jié)果表明,膠體金免疫層析試紙條的靈敏度是瓊脂糖凝膠電泳的100倍,與常見(jiàn)病原菌無(wú)特異性反應(yīng),可以對(duì)牛分枝桿菌及結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行區(qū)分,為牛結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷提供技術(shù)支持,對(duì)牛結(jié)核病的防控具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.23

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