本文關(guān)鍵詞：山羊SREBP-1A及SREBP-1C的克隆鑒定及功能初步研究

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【摘要】：固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(Sterol Regulatory Element Binding Protein,SREBPs)是體內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子家族,對哺乳動物脂質(zhì)及膽固醇生物合成過程有重要調(diào)節(jié)作用。SREBP-1是脂質(zhì)合成過程中的主要調(diào)節(jié)因子之一,同時是奶牛泌乳期乳腺組織乳脂合成過程中的核心調(diào)節(jié)因子,對乳脂肪酸的從頭合成、轉(zhuǎn)運、去飽和、延伸、甘油三酯合成及脂滴生成及分泌過程均有重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),SREBP-1轉(zhuǎn)錄因子家族包括兩個亞型:SREBP-1a及SREBP-1c,人和小鼠等模式動物中對該兩個基因亞型的序列結(jié)構(gòu)差異及功能差異已有過相關(guān)報道。但是,在反芻動物如牛及山羊上,SREBP-1家族兩個亞型的序列差異仍未有過任何報道。本研究通過對西農(nóng)薩能羊SREBF1基因的兩個亞型SREBP-1a及SREBP-1c的啟動子進行克隆,鑒定出了西農(nóng)薩能奶山羊SREBP-1a、SREBP-1c基因序列差異,并構(gòu)建該兩個基因的pcDNA3.1超表達載體,轉(zhuǎn)染山羊原代乳腺上皮細胞后,RT-qPCR方法檢測SREBP-1a、SREBP-1c基因超表達后對脂肪酸代謝相關(guān)基因表達水平的影響,以及細胞內(nèi)總膽固醇含量的變化,為進一步研究該基因家族在脂肪酸代謝及泌乳調(diào)控過程中的不同功能奠定基礎(chǔ)。獲得的主要研究結(jié)果如下:(1)通過對山羊基因組序列及SREBP-1基因cDNA序列的比對,利用啟動子克隆技術(shù),擴增得到山羊SREBP-1a及SREBP-1c基因的啟動子序列,分別包括轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 947 bp及2 012 bp。將克隆得到的啟動子序列分別構(gòu)建啟動子熒光素酶報告基因載體(pGL3-basic),轉(zhuǎn)染山羊原代乳腺上皮細胞,48 h后檢測啟動子活性,結(jié)果表明,克隆得到的啟動子片段均為具有較高活性的啟動子序列。(2)根據(jù)克隆得到的SREBF1基因家族兩個亞型的啟動子序列,分別設(shè)計引物擴增山羊SREBP-1a及SREBP-1c基因。結(jié)果表明,擴增得到1209 bp的SREBP-1a及1 137bp的SREBP-1c基因序列。兩個亞型的序列差異主要在氨基末端,SREBP-1a基因的序列長度比SREBP-1c基因的序列長度多出72 bp,其余部分完全相同。(3)分別構(gòu)建SREBP-1a及SREBP-1c基因的pcDNA3.1超表達重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染山羊原代乳腺上皮細胞。48 h后,RT-qPCR檢測結(jié)果表明:與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1對照組相比,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SREBP-1a及pcDNA3.1-SREBP-1c處理組分別導(dǎo)致SREBP-1a及SREBF1基因顯著上調(diào)10倍左右及30倍以上,同時導(dǎo)致脂肪酸合成相關(guān)基因脂肪酸合酶FASN、硬脂酰輔酶A去飽和酶SCD1、�；o酶A羧化酶ACACA、超長鏈脂肪酸延伸酶ELOVL6及磷脂磷酸酶LPIN1均顯著上調(diào)(P0.05)。SREBP-1a及SREBP-1c的超表達導(dǎo)致細胞內(nèi)膽固醇含量的上調(diào)(P0.05)。綜上所述,本研究通過對西農(nóng)薩能羊SREBF1家族兩個亞型的啟動子進行分別克隆,并根據(jù)兩個亞型的啟動子序列鑒定得到SREBP-1a、SREBP-1c基因的成熟形式核苷酸序列,分別構(gòu)建pcDNA3.1超表達載體后轉(zhuǎn)染山羊原代乳腺上皮細胞后,導(dǎo)致脂肪酸合成代謝的相關(guān)基因的mRNA表達量顯著上調(diào),細胞中總膽固醇的含量上調(diào),而細胞中總甘油三酯含量無明顯變化。研究結(jié)果為進一步明確SREBF1基因的兩個亞型在乳腺脂肪酸代謝過程中的具體功能提供了理論基礎(chǔ)及實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S827

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1 楊云超;山羊SREBP-1A及SREBP-1C的克隆鑒定及功能初步研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

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本文編號：1241478