本文關(guān)鍵詞：山羊SREBP-1A及SREBP-1C的克隆鑒定及功能初步研究

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【摘要】：固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(Sterol Regulatory Element Binding Protein,SREBPs)是體內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子家族,對哺乳動(dòng)物脂質(zhì)及膽固醇生物合成過程有重要調(diào)節(jié)作用。SREBP-1是脂質(zhì)合成過程中的主要調(diào)節(jié)因子之一,同時(shí)是奶牛泌乳期乳腺組織乳脂合成過程中的核心調(diào)節(jié)因子,對乳脂肪酸的從頭合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、去飽和、延伸、甘油三酯合成及脂滴生成及分泌過程均有重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),SREBP-1轉(zhuǎn)錄因子家族包括兩個(gè)亞型:SREBP-1a及SREBP-1c,人和小鼠等模式動(dòng)物中對該兩個(gè)基因亞型的序列結(jié)構(gòu)差異及功能差異已有過相關(guān)報(bào)道。但是,在反芻動(dòng)物如牛及山羊上,SREBP-1家族兩個(gè)亞型的序列差異仍未有過任何報(bào)道。本研究通過對西農(nóng)薩能羊SREBF1基因的兩個(gè)亞型SREBP-1a及SREBP-1c的啟動(dòng)子進(jìn)行克隆,鑒定出了西農(nóng)薩能奶山羊SREBP-1a、SREBP-1c基因序列差異,并構(gòu)建該兩個(gè)基因的pcDNA3.1超表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染山羊原代乳腺上皮細(xì)胞后,RT-qPCR方法檢測SREBP-1a、SREBP-1c基因超表達(dá)后對脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響,以及細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量的變化,為進(jìn)一步研究該基因家族在脂肪酸代謝及泌乳調(diào)控過程中的不同功能奠定基礎(chǔ)。獲得的主要研究結(jié)果如下:(1)通過對山羊基因組序列及SREBP-1基因cDNA序列的比對,利用啟動(dòng)子克隆技術(shù),擴(kuò)增得到山羊SREBP-1a及SREBP-1c基因的啟動(dòng)子序列,分別包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 947 bp及2 012 bp。將克隆得到的啟動(dòng)子序列分別構(gòu)建啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體(pGL3-basic),轉(zhuǎn)染山羊原代乳腺上皮細(xì)胞,48 h后檢測啟動(dòng)子活性,結(jié)果表明,克隆得到的啟動(dòng)子片段均為具有較高活性的啟動(dòng)子序列。(2)根據(jù)克隆得到的SREBF1基因家族兩個(gè)亞型的啟動(dòng)子序列,分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增山羊SREBP-1a及SREBP-1c基因。結(jié)果表明,擴(kuò)增得到1209 bp的SREBP-1a及1 137bp的SREBP-1c基因序列。兩個(gè)亞型的序列差異主要在氨基末端,SREBP-1a基因的序列長度比SREBP-1c基因的序列長度多出72 bp,其余部分完全相同。(3)分別構(gòu)建SREBP-1a及SREBP-1c基因的pcDNA3.1超表達(dá)重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染山羊原代乳腺上皮細(xì)胞。48 h后,RT-qPCR檢測結(jié)果表明:與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1對照組相比,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SREBP-1a及pcDNA3.1-SREBP-1c處理組分別導(dǎo)致SREBP-1a及SREBF1基因顯著上調(diào)10倍左右及30倍以上,同時(shí)導(dǎo)致脂肪酸合成相關(guān)基因脂肪酸合酶FASN、硬脂酰輔酶A去飽和酶SCD1、�；o酶A羧化酶ACACA、超長鏈脂肪酸延伸酶ELOVL6及磷脂磷酸酶LPIN1均顯著上調(diào)(P0.05)。SREBP-1a及SREBP-1c的超表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的上調(diào)(P0.05)。綜上所述,本研究通過對西農(nóng)薩能羊SREBF1家族兩個(gè)亞型的啟動(dòng)子進(jìn)行分別克隆,并根據(jù)兩個(gè)亞型的啟動(dòng)子序列鑒定得到SREBP-1a、SREBP-1c基因的成熟形式核苷酸序列,分別構(gòu)建pcDNA3.1超表達(dá)載體后轉(zhuǎn)染山羊原代乳腺上皮細(xì)胞后,導(dǎo)致脂肪酸合成代謝的相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào),細(xì)胞中總膽固醇的含量上調(diào),而細(xì)胞中總甘油三酯含量無明顯變化。研究結(jié)果為進(jìn)一步明確SREBF1基因的兩個(gè)亞型在乳腺脂肪酸代謝過程中的具體功能提供了理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S827

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1 楊云超;山羊SREBP-1A及SREBP-1C的克隆鑒定及功能初步研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1241478