發(fā)布時間：2017-11-23 23:26

  本文關(guān)鍵詞：檢測大腸桿菌菌毛的新型凝集技術(shù)研究

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【摘要】：產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)作為最主要的腸道病原菌,常引起犢牛、羔羊、仔豬等幼畜腹瀉,在世界大部分地區(qū)廣泛流行,具有高發(fā)病率和死亡率,給畜牧業(yè)帶來嚴重的損失,因此建立一種快速、簡便、靈敏、特異的診斷技術(shù)對防治該病具有重要意義。ETEC可在菌毛黏附素協(xié)助下定植在腸道內(nèi),繼而產(chǎn)生腸毒素,引起幼畜腹瀉。許多ETEC菌株帶有菌毛黏附素,如K88、K99、987p和F41,因此,通過快速檢測菌毛黏附素,可為ETEC的檢測提供重要的參考依據(jù)。本研究旨在通過提取ETEC菌毛K88ab、K99、987p和F41,免疫新西蘭白兔制備單因子血清;以彩色二氧化硅微球(Colored Silica Nanoparticles,CSN)為載體,將單因子血清修飾到微球表面,制備免疫彩色二氧化硅微球(Immune Colored Silica Nanoparticles,ICSN),建立一種新型間接凝集技術(shù)用于K88ab、K99、987p和F41菌毛的快速檢測。單因子血清的制備。分別提取四種菌毛,免疫新西蘭白兔,每隔21 d免疫一次,共免疫3次;無菌采集兔心血制備抗血清,玻片凝集試驗結(jié)果顯示,抗K88ab、K99、987p和F41血清凝集價分別為1:256、1:512、1:128和1:4096。交叉凝集試驗結(jié)果顯示,K88ab抗血清與K99抗原凝集價為1:32,K99、987p和F41抗血清均與K88抗原交叉凝集,凝集價分別為1:8、1:16和1:16。通過反應(yīng)條件優(yōu)化,最終確定將抗血清和與之有交叉凝集的菌體壓積1:1混合,4℃48h吸收交叉抗體。結(jié)果顯示,吸收后的抗K88ab、K99、987p和F41血清只與自身抗原發(fā)生凝集反應(yīng),特異性良好,凝集價分別為1:64、1:256、1:32和1:2048。ICSN的制備及應(yīng)用。用反相微乳液法制備的CSN與單因子血清結(jié)合制備了不同顏色的K88ab、K99、987p和F41 ICSN,同時使用三種不同顏色的ICSN檢測抗原,結(jié)果顯示顏色對凝集效果沒有影響。通過反應(yīng)條件優(yōu)化,最終確定玻片凝集試驗的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為:ICSN 20μL、菌液20μL(菌液濃度范圍為106~109CFU?m L-1),25℃~37℃反應(yīng)1 min。特異性實驗結(jié)果顯示,K88ab、K99、987p和F41 ICSN與ETEC C83903(K88ab+)、C82529(K99+)、C83915(987p+)、O142(F41+)、大腸桿菌DN69-A、大腸桿菌DN89-B、綠膿桿菌(SD004)、豬丹毒桿菌(CVCC124)、豬霍亂沙門氏菌(CVCC503)、巴氏桿菌(CVCC430)、生理鹽水不發(fā)生交叉凝集反應(yīng)。敏感性實驗結(jié)果顯示,K88ab、K99、987p和F41 ICSN對菌液的最小檢出濃度為1.0~5.1×106CFU?m L-1。制備的ICSN在4℃保存30 d,其特異性、敏感性沒有明顯變化,具有良好的穩(wěn)定性。對雙盲樣品的檢測結(jié)果同實際樣品的檢測結(jié)果,100%符合。新型凝集試驗結(jié)果直觀、易于判斷,且每次使用的抗體量為玻片凝集試驗的1/500,適用于抗體量少而檢測樣品多的情況。本研究建立了一種以CSN為載體,用于檢測ETEC K88ab、K99、987p、F41菌毛的新型間接凝集試驗,為幼畜大腸桿菌性腹瀉的診斷與防治提供了簡便、快速、敏感、特異的檢測方法。
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
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本文編號：1220248