發(fā)布時間：2017-11-22 18:12

  本文關(guān)鍵詞：CpG佐劑對羊細(xì)粒棘球蚴Eg95抗原的免疫增強作用研究

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【摘要】：細(xì)菌基因組DNA中存在具有免疫學(xué)刺激活性、以未甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸為核心的脫氧核苷酸序列,即CpG基序(CpG motif)。CpG ODN是指含有CpG基序的寡脫氧核苷酸。CpG ODN通過與胞內(nèi)受體的TLR9結(jié)合,活化pDC細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞,可以作為一種潛在免疫增強劑,激活固有免疫應(yīng)答,促進免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生IL-12、TNF-α、IFN-α/β和IFN-γ等細(xì)胞因子,促進Th1型適應(yīng)性免疫反應(yīng)。人工合成的含有5’-GACGTT-3’堿基序列的CpG ODN對小鼠免疫系統(tǒng)具有強烈的免疫刺激作用。pUC18-CpG質(zhì)粒則是將含有10拷貝GACGTT的CpG基序克隆至pUC18載體中構(gòu)建而成,由本實驗室保存。將人工合成的CpG ODN和pUC18-CpG質(zhì)粒分別刺激RAW264.7細(xì)胞,提取總RNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,采用實時熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞因子和干擾素(IFN-β、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-12p40)的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示,在CpG ODN或pUC18-CpG刺激下,除IFN-γ外,IFN-β、IL-1β、TNF-α、IL-12p40的相對表達(dá)量分別達(dá)到了17.22±1.33、64.56±3.87、4.45±0.25、79.50±4.87和11.17±1.34、10.61±0.69、5.56±0.41、51.17±2.56,差異顯著(P0.05);除TNF-α外,CpG ODN刺激IFN-β、IL-12p40和IL-1β相對表達(dá)量較pUC18-CpG刺激表達(dá)量差異更顯著(P0.05)。重組pET-32a-3Eg95大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),親和層析純化出重組蛋白3Eg95。重組蛋白分別與常規(guī)佐劑Quli-A、pUC18-CpG和CpG ODN配伍后,免疫小鼠。通過間接ELISA方法監(jiān)測各組抗體效價平均水平,采用實時熒光定量PCR方法測定體外刺激實驗后細(xì)胞因子的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示,pUC18-CpG組和CpG ODN組小鼠免疫后14天、28天以及42天ELISA抗體平均水平(OD450nm)分別為3.10±0.07、3.03±0.15、3.22±0.05和2.98±0.10、3.12±0.06、3.27±0.33,與Quli-A組抗體平均水平相比均差異均顯著(P0.05);CpG ODN組抗體平均水平略高于pUC18-CpG組,但差異不顯著(P≥0.05)。體外制備小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,經(jīng)重組蛋白刺激后,pUC18-CpG組與CpG ODN組細(xì)胞IFN-β、IFN-γ和TNF-α的相對表達(dá)量分別為6.88±0.32、2.35±0.45、6.28±0.21和5.03±0.50、2.85±0.18、7.07±1.01,與Quli-A組相比差異均顯著(P0.05)。因此,在細(xì)胞免疫水平方面,pUC18-CpG和CpG ODN均能上調(diào)I型IFN和促炎性因子的表達(dá),具有誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)的特性;相對于常規(guī)佐劑Quli-A,pUC18-CpG和CpG ODN在體液免疫和細(xì)胞免疫方面對Eg95抗原都有顯著的免疫增強作用,CpG ODN的免疫增強作用略優(yōu)于pUC18-CpG,兩者均可作為免疫佐劑,增強現(xiàn)有包蟲病基因工程疫苗的免疫效果。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4

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本文編號：1215592