本文關鍵詞：外泌小體介導豬瘟病毒在ST細胞之間擴散的機制研究

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【摘要】：豬瘟是由豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的豬烈性傳染病。CSFV如何劫持宿主細胞的生物合成系統(tǒng)來進行病毒粒子的釋放和擴散尚不清楚。大量研究證實,攜帶病毒基因組或病毒粒子的外泌小體(exosome)能夠介導病毒在細胞之間的傳遞從而引起病毒感染。目前,外泌小體是否也能夠攜帶豬瘟病毒基因組RNA或病毒粒子從而介導病毒在細胞之間的擴散尚未報道。為了研究外泌小體在豬瘟病毒擴散和感染中的作用,本研究利用Total exosome isolation kit結合碘克沙醇密度梯度離心對豬瘟病毒GD53株感染豬睪丸細胞(swine testicle,ST)培養(yǎng)上清中的外泌小體(GD53-外泌小體)進行提純。提取的GD53-外泌小體進行電鏡觀察、Western blot、Real-time PCR及病毒滴度測定以鑒定外泌小體是否介導CSFV在細胞之間的感染和擴散。同時構建僅含豬瘟非結構蛋白的亞基因組復制子(GD53-SGR)及其細胞系,將亞基因組復制子細胞系產(chǎn)生的外泌小體(SGR-外泌小體)與正常ST細胞孵育,明確外泌小體是否介導GD53-SGR在ST細胞之間的擴散。電鏡觀察發(fā)現(xiàn),提取的外泌小體直徑為30-80 nm。Western blot結果顯示,從GD53感染細胞培養(yǎng)上清中提取的GD53-外泌小體含有標志蛋白TSG101和Alix,但不含有病毒蛋白Core和Npro蛋白。進一步分析發(fā)現(xiàn),外泌小體和感染性粒子主要存在于12-21%碘克沙醇密度層中,其中15%和18%密度層中外泌小體標志蛋白TSG101以及感染性粒子的數(shù)目最多,表明感染性粒子的滴度與外泌小體的量成正相關。純化的外泌小體樣品病毒全長基因組RT-PCR擴增和病毒滴度測定發(fā)現(xiàn)外泌小體含有病毒基因組RNA且具有感染性,這些結果初步表明外泌小體能介導豬瘟病毒在細胞之間的擴散。有意思的是,從GD53-SGR細胞系提取的SGR-外泌小體能進入正常的ST細胞,表明外泌小體可以攜帶CSFV GD53-SGR在細胞之間進行傳遞。綜上所述,本研究成功分離和純化了豬瘟病毒感染ST細胞產(chǎn)生的外泌小體,這些病毒修飾的外泌小體不含病毒結構蛋白Core,但能攜帶病毒基因組RNA或亞基因組復制子RNA從而獲得感染細胞的能力,可以介導豬瘟病毒在細胞之間進行擴散。因此,本研究更新了我們對豬瘟病毒粒子存在形式的傳統(tǒng)認識,為進一步闡明外泌小體介導豬瘟病毒擴散與感染的分子機制奠定基礎。
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651

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本文編號：1194340