本文關(guān)鍵詞：實驗動物金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體多重PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

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【摘要】：目的:實驗動物是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和條件,實驗動物的質(zhì)量直接影響眾多領(lǐng)域科學(xué)實驗的準(zhǔn)確性,也關(guān)系到實驗動物從業(yè)人員和動物實驗操作者的健康。因此,實驗動物的微生物質(zhì)量控制已納入國家標(biāo)準(zhǔn)。肺支原體(Mycoplasma pulmonis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是實驗動物微生物檢測需要排除的病原體,也是實驗動物常見的易感病原體,在大小鼠、豚鼠、地鼠和兔中感染率可達(dá)到百分之幾,甚至百分之幾十,相對其它病原體感染率較高。目前對實驗動物攜帶的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體的鑒定主要以分離純化培養(yǎng)、生化試驗等方法進(jìn)行,存在費時費力、需要有經(jīng)驗的技術(shù)人員以客觀指標(biāo)加主觀判斷鑒定的缺點,如金黃色葡萄球菌從分離細(xì)菌到發(fā)出檢測報告往往需要48h,綠膿桿菌需要長達(dá)72h,而肺支原體培養(yǎng)完成檢測則需21天。而PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)以其簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點已在臨床醫(yī)學(xué)疾病診斷等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,理論上同樣也可應(yīng)用于實驗動物的病原微生物檢測,但普通PCR方法單管每次只能檢測一種病原體,不能滿足單管檢測多種病原體的實際需要,更滿足不了大樣本、快速、準(zhǔn)確的檢測。多重PCR(multiplex PCR)可以在同一管反應(yīng)體系中擴(kuò)增出大小不同的核酸片段,具有快捷方便、高通量等優(yōu)點。多重PCR如果應(yīng)用在實驗動物微生物檢測中,可以同時檢測多種病原體,適合大量實驗動物微生物檢測與鑒定,具有高靈敏性、高效性、高特異性和低成本性等優(yōu)點。本研究目的是針對三種實驗動物病原體金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體,建立多重PCR檢測方法,并與傳統(tǒng)的微生物檢測方法比較,檢驗多重PCR檢測方法的可操作性和準(zhǔn)確性。方法:1、將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株轉(zhuǎn)接到SP瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)接到血液瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行分離與純化培養(yǎng),顯微鏡鏡下觀察,進(jìn)行血漿凝固酶試驗和甘露醇發(fā)酵試驗;將綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株轉(zhuǎn)接到NAC液體培養(yǎng)基,后轉(zhuǎn)接到nac固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離與純化培養(yǎng),顯微鏡鏡下觀察,生化鑒定,氧化酶試驗,42℃生長試驗;將肺支原體接到液體培養(yǎng)基中,一周后進(jìn)行觀察。2、通過文獻(xiàn)查找肺支原體、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌特異性引物,使用blast分析各病原體引物特異性;進(jìn)行pcr擴(kuò)增,對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,通過生物信息學(xué)分析驗證擴(kuò)增產(chǎn)物正確性;3、優(yōu)化pcr反應(yīng)體系,檢測pcr方法的特異性和敏感性。將模板dna按照10倍的比例進(jìn)行梯度稀釋,分別以稀釋后的模板dna進(jìn)行擴(kuò)增;用接種針挑取菌落加入到裝有普通營養(yǎng)肉湯的試管中,放入37℃恒溫?fù)u床中進(jìn)行擴(kuò)菌,將搖好的菌液按著10倍比例進(jìn)行梯度稀釋,轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),提取菌液核酸進(jìn)行pcr擴(kuò)增;pcr擴(kuò)增其他非目的菌進(jìn)行特異性實驗。4、將肺支原體、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的基因組dna在同一反應(yīng)體系同時擴(kuò)增,并且在反應(yīng)體系中加入細(xì)菌通用引物做為內(nèi)質(zhì)控,調(diào)整和優(yōu)化反應(yīng)體系成分和反應(yīng)條件,建立三種病原體多重pcr檢測方法。選擇具有實驗動物生產(chǎn)資質(zhì)的單位供應(yīng)的動物:大小鼠共45只,采集實驗動物回盲部內(nèi)容物或糞便以及動物氣管分泌物,提取核酸進(jìn)行三種病原體多重pcr的檢測,同時進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法,將兩種檢測結(jié)果比較,檢驗多重pcr檢測方法的可操作性和準(zhǔn)確性。結(jié)果:1、金黃色葡萄球菌在sp固體培養(yǎng)基上形成黃色的菌落,轉(zhuǎn)接血瓊脂平皿形成灰白色、周圍有β溶血環(huán)的菌落;菌體形態(tài)為革蘭陽性球菌,排列成葡萄狀;甘露醇發(fā)酵試驗為陽性;血漿凝固酶試驗為陽性。綠膿桿菌在nac瓊脂平皿上形成扁平菌落,邊緣不齊呈鋸齒狀,大部分菌落可產(chǎn)生綠色色素而致使培養(yǎng)基呈綠色;菌體特征為革蘭陰性桿菌,菌體長短不一;各生化鑒定管陰陽性結(jié)果正確;氧化酶試驗和42℃生長試驗為陽性。肺支原體液體培養(yǎng)顏色由紅色變?yōu)辄S色。2、獲得三種病原體的特異性引物,并通過blast比對驗證引物的特異性,金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為153bp、375bp和266bp,其測序結(jié)果分別與genebank對應(yīng)序列(sequenceid分別為:gb|dq507378.1、dbj|ab926025.1、gb|kp836312.1)相似度分別為97.00%、98.90%和99.59%。3、PCR特異性實驗:金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體特異性實驗結(jié)果,除標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增出陽性條帶外,其它菌種均擴(kuò)增陰性;敏感性實驗:金黃色葡萄球菌PCR擴(kuò)增最小檢出DNA核酸量為1pg、最小檢出菌落數(shù)為2CFU;綠膿桿菌PCR擴(kuò)增最小檢出DNA核酸量為10pg,最小檢出菌落數(shù)為14CFU;肺支原體PCR擴(kuò)增最小檢出DNA核酸量為1pg。4、建立了金黃色葡萄球菌、肺支原體、綠膿桿菌和細(xì)菌通用基因的多重PCR擴(kuò)增體系,其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳出四個條帶,片段大小從小到大分別為153bp、266bp、375bp和520bp。PCR檢測實驗動物24h培養(yǎng)物中的菌落,其結(jié)果與實驗動物微生物檢測結(jié)果一致;檢測實驗動物糞便,檢測結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法相比有差異。結(jié)論:成功建立金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體多重PCR檢測體系,有較好的敏感性、特異性和重復(fù)性。用于實驗動物微生物檢測,檢測結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法一致,并且多重PCR方法快速、簡便、準(zhǔn)確,初步驗證了本檢測方法具有良好的可操作性和準(zhǔn)確性,為今后應(yīng)用于實驗動物微生物的檢測奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.91

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙青;鳳曉博;;食品中A族乙型溶血性鏈球菌的PCR檢測[J];四川畜牧獸醫(yī);2015年07期

2 熊煒;林穎崢;魏曉鋒;王艷;張強(qiáng);李健;胡建華;黃忠榮;;淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒快速核酸檢測方法[J];中國動物檢疫;2015年04期

3 李繼平;金劍;秦川;;實驗動物在醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究與發(fā)展中的作用[J];中國醫(yī)藥導(dǎo)報;2014年31期

4 馮育芳;邢進(jìn);鞏薇;岳秉飛;賀爭鳴;;應(yīng)用PCR方法對三種新型實驗動物鉤端螺旋體感染情況的調(diào)查研究[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2014年08期

5 戴方偉;宋曉明;盧領(lǐng)群;周莎桑;薩曉嬰;呂宇;應(yīng)華忠;;PCR-測序法對嚙齒類動物漢坦病毒的檢測和基因分型[J];中國實驗動物學(xué)報;2014年03期

6 肖躍強(qiáng);劉吉山;楊慧;沈志強(qiáng);丁壯;;兔出血癥病毒RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J];中國動物傳染病學(xué)報;2014年03期

7 陳菲菲;狄紅霞;藍(lán)樂夫;;金黃色葡萄球菌重要毒力因子的功能及其抑制劑研究進(jìn)展[J];科學(xué)通報;2013年36期

8 王吉;衛(wèi)禮;付瑞;李曉波;馮育芳;王淑菁;岳秉飛;賀爭鳴;;長爪沙鼠小鼠肝炎病毒(MHV)RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2013年02期

9 佟巍;;國內(nèi)外實驗動物病毒檢測的比較[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2012年11期

10 付瑞;岳秉飛;賀爭鳴;;鼠痘病毒PCR檢測方法的建立及在鼠源性生物制品檢定中的應(yīng)用[J];實驗動物科學(xué);2012年03期

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本文編號：1184144