本文關(guān)鍵詞：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體多重PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

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【摘要】：目的:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和條件,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量直接影響眾多領(lǐng)域科學(xué)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,也關(guān)系到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從業(yè)人員和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作者的健康。因此,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物質(zhì)量控制已納入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。肺支原體(Mycoplasma pulmonis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)需要排除的病原體,也是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常見(jiàn)的易感病原體,在大小鼠、豚鼠、地鼠和兔中感染率可達(dá)到百分之幾,甚至百分之幾十,相對(duì)其它病原體感染率較高。目前對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攜帶的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體的鑒定主要以分離純化培養(yǎng)、生化試驗(yàn)等方法進(jìn)行,存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、需要有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員以客觀指標(biāo)加主觀判斷鑒定的缺點(diǎn),如金黃色葡萄球菌從分離細(xì)菌到發(fā)出檢測(cè)報(bào)告往往需要48h,綠膿桿菌需要長(zhǎng)達(dá)72h,而肺支原體培養(yǎng)完成檢測(cè)則需21天。而PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)以其簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)已在臨床醫(yī)學(xué)疾病診斷等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,理論上同樣也可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病原微生物檢測(cè),但普通PCR方法單管每次只能檢測(cè)一種病原體,不能滿足單管檢測(cè)多種病原體的實(shí)際需要,更滿足不了大樣本、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。多重PCR(multiplex PCR)可以在同一管反應(yīng)體系中擴(kuò)增出大小不同的核酸片段,具有快捷方便、高通量等優(yōu)點(diǎn)。多重PCR如果應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)中,可以同時(shí)檢測(cè)多種病原體,適合大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)與鑒定,具有高靈敏性、高效性、高特異性和低成本性等優(yōu)點(diǎn)。本研究目的是針對(duì)三種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原體金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體,建立多重PCR檢測(cè)方法,并與傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法比較,檢驗(yàn)多重PCR檢測(cè)方法的可操作性和準(zhǔn)確性。方法:1、將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株轉(zhuǎn)接到SP瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)接到血液瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行分離與純化培養(yǎng),顯微鏡鏡下觀察,進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)和甘露醇發(fā)酵試驗(yàn);將綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株轉(zhuǎn)接到NAC液體培養(yǎng)基,后轉(zhuǎn)接到nac固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離與純化培養(yǎng),顯微鏡鏡下觀察,生化鑒定,氧化酶試驗(yàn),42℃生長(zhǎng)試驗(yàn);將肺支原體接到液體培養(yǎng)基中,一周后進(jìn)行觀察。2、通過(guò)文獻(xiàn)查找肺支原體、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌特異性引物,使用blast分析各病原體引物特異性;進(jìn)行pcr擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,通過(guò)生物信息學(xué)分析驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物正確性;3、優(yōu)化pcr反應(yīng)體系,檢測(cè)pcr方法的特異性和敏感性。將模板dna按照10倍的比例進(jìn)行梯度稀釋,分別以稀釋后的模板dna進(jìn)行擴(kuò)增;用接種針挑取菌落加入到裝有普通營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中,放入37℃恒溫?fù)u床中進(jìn)行擴(kuò)菌,將搖好的菌液按著10倍比例進(jìn)行梯度稀釋,轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),提取菌液核酸進(jìn)行pcr擴(kuò)增;pcr擴(kuò)增其他非目的菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。4、將肺支原體、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的基因組dna在同一反應(yīng)體系同時(shí)擴(kuò)增,并且在反應(yīng)體系中加入細(xì)菌通用引物做為內(nèi)質(zhì)控,調(diào)整和優(yōu)化反應(yīng)體系成分和反應(yīng)條件,建立三種病原體多重pcr檢測(cè)方法。選擇具有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)資質(zhì)的單位供應(yīng)的動(dòng)物:大小鼠共45只,采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物回盲部?jī)?nèi)容物或糞便以及動(dòng)物氣管分泌物,提取核酸進(jìn)行三種病原體多重pcr的檢測(cè),同時(shí)進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法,將兩種檢測(cè)結(jié)果比較,檢驗(yàn)多重pcr檢測(cè)方法的可操作性和準(zhǔn)確性。結(jié)果:1、金黃色葡萄球菌在sp固體培養(yǎng)基上形成黃色的菌落,轉(zhuǎn)接血瓊脂平皿形成灰白色、周圍有β溶血環(huán)的菌落;菌體形態(tài)為革蘭陽(yáng)性球菌,排列成葡萄狀;甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)為陽(yáng)性;血漿凝固酶試驗(yàn)為陽(yáng)性。綠膿桿菌在nac瓊脂平皿上形成扁平菌落,邊緣不齊呈鋸齒狀,大部分菌落可產(chǎn)生綠色色素而致使培養(yǎng)基呈綠色;菌體特征為革蘭陰性桿菌,菌體長(zhǎng)短不一;各生化鑒定管陰陽(yáng)性結(jié)果正確;氧化酶試驗(yàn)和42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)為陽(yáng)性。肺支原體液體培養(yǎng)顏色由紅色變?yōu)辄S色。2、獲得三種病原體的特異性引物,并通過(guò)blast比對(duì)驗(yàn)證引物的特異性,金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為153bp、375bp和266bp,其測(cè)序結(jié)果分別與genebank對(duì)應(yīng)序列(sequenceid分別為:gb|dq507378.1、dbj|ab926025.1、gb|kp836312.1)相似度分別為97.00%、98.90%和99.59%。3、PCR特異性實(shí)驗(yàn):金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,除標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶外,其它菌種均擴(kuò)增陰性;敏感性實(shí)驗(yàn):金黃色葡萄球菌PCR擴(kuò)增最小檢出DNA核酸量為1pg、最小檢出菌落數(shù)為2CFU;綠膿桿菌PCR擴(kuò)增最小檢出DNA核酸量為10pg,最小檢出菌落數(shù)為14CFU;肺支原體PCR擴(kuò)增最小檢出DNA核酸量為1pg。4、建立了金黃色葡萄球菌、肺支原體、綠膿桿菌和細(xì)菌通用基因的多重PCR擴(kuò)增體系,其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳出四個(gè)條帶,片段大小從小到大分別為153bp、266bp、375bp和520bp。PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24h培養(yǎng)物中的菌落,其結(jié)果與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)結(jié)果一致;檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便,檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法相比有差異。結(jié)論:成功建立金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體多重PCR檢測(cè)體系,有較好的敏感性、特異性和重復(fù)性。用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法一致,并且多重PCR方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,初步驗(yàn)證了本檢測(cè)方法具有良好的可操作性和準(zhǔn)確性,為今后應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.91

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1184144