本文關(guān)鍵詞：融合表達(dá)TGEV 6Ds與PEDV ps420非抗性標(biāo)記重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及免疫效果評(píng)價(jià)

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【摘要】：豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是引起豬病毒性腹瀉的主要病原,二者同屬冠狀病毒,所致疾病的臨床特征相似,并多以混合感染。仔豬感染的死亡率最高可達(dá)到100%,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。研究表明,黏膜免疫是有效的防治途徑。因此,研究能有效預(yù)防TGEV與PEDV感染的口服疫苗具有重要的實(shí)踐意義。本研究以TGEV S蛋白D抗原中和位點(diǎn)的6個(gè)核酸重復(fù)序列6Ds和PEDV S蛋白中和抗原表位區(qū)ps420核酸序列為靶基因,定向插入組成型乳酸乳桿菌表達(dá)載體p PG-T7g10-PPT構(gòu)建了融合表達(dá)6Ds-ps420蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒p PG-T7g10-6Ds-ps420。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入干酪乳桿菌L.casei 393,獲得了陽(yáng)性重組干酪乳酸桿菌p PG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei 393。將重組菌p PG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei 393在MRS培養(yǎng)液中37℃靜置培養(yǎng)16 h,經(jīng)Western-blot檢測(cè),目的蛋白獲得表達(dá),目的蛋白大小約為80 k Da。在此基礎(chǔ)上,以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP作為報(bào)告基因?qū)?gòu)建的重組質(zhì)粒pPG-T7g10-6Ds-ps420進(jìn)行改造,將EGFP基因與融合基因6Ds-ps420串聯(lián),獲得了重組質(zhì)粒p PG-T7g10-EGFP-6Ds-ps420,電轉(zhuǎn)入干酪乳桿菌L.casei393,獲得了陽(yáng)性重組菌p PG-T7g10-EGFP-6Ds-ps420/L.casei 393。對(duì)培養(yǎng)的重組菌進(jìn)行Western blot和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè),結(jié)果顯示,目的蛋白獲得表達(dá)。然后,通過酶切方法將重組質(zhì)粒p PG-T7g10-EGFP-6Ds-ps420中的抗性標(biāo)記氯霉素基因切除,平端自連后電轉(zhuǎn)入干酪乳桿菌,通過流式細(xì)胞技術(shù)篩選非抗性標(biāo)記(EGFP標(biāo)記)的重組干酪乳桿菌pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei 393。經(jīng)Western-blot鑒定,重組目的蛋白能夠正確表達(dá),大小約為110k Da。本研究以BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,對(duì)重組菌p PG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei 393的免疫原性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。將小鼠隨機(jī)分成4組:PPG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei 393組、pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei 393組、pPG-T7g10-PPT/L.casei 393空載體組和PBS組。每只小鼠口服免疫2×109 CFU的干酪乳桿菌或200μl PBS,共免疫三次,免疫時(shí)間間隔為2周,每次連免3天,每天1次。采集不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清、糞便和外生殖道黏液樣本,利用TGEV和PEDV全病毒作為包被抗原,通過間接ELISA方法檢測(cè)免疫樣本中的抗體水平。檢測(cè)結(jié)果顯示,p PG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei 393免疫組和pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei 393免疫組小鼠Ig A和Ig G抗體水平均顯著高于PBS組和pPG-T7g10-PPT/L.casei 393組,而pPG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei 393免疫組和pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei 393免疫組之間抗體水平差異不顯著。脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,5μg/m L的TGEV 6Ds抗原/PEDV ps420抗原具有顯著的促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖作用。免疫血清抗體中和病毒活性檢測(cè)結(jié)果顯示,p PG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei 393免疫組小鼠抗血清對(duì)TGEV和PEDV的中和效價(jià)分別為1:100和1:112.2,pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei 393免疫組小鼠抗血清對(duì)TGEV和PEDV的中和效價(jià)分別為1:63.8和1:100,組間差異不顯著。綜上所述,本研究以EGFP為選擇標(biāo)記,成功構(gòu)建了融合表達(dá)TGEV 6Ds和PEDV ps420蛋白的非抗性標(biāo)記重組干酪乳桿菌系統(tǒng)p PG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei 393,經(jīng)動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí),該重組菌具有良好的免疫原性,為進(jìn)一步探索新型豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉口服二聯(lián)疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.6

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本文編號(hào)：1183139