本文關(guān)鍵詞：多殺性巴氏桿菌轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白的表達(dá)及免疫原性研究

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【摘要】：多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)是能引起牛、豬、家禽、兔等多種動物傳染病的病原體,臨床上多以出血性敗血癥和呼吸系統(tǒng)疾病的形式出現(xiàn),影響動物的健康生長,給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失�，F(xiàn)在防治巴氏桿菌病的主要措施是注射疫苗和使用藥物,現(xiàn)有的疫苗主要有滅活疫苗、弱毒疫苗和亞單位疫苗。鐵是微生物代謝過程中電子轉(zhuǎn)移鏈的必需元素。動物體內(nèi)含有多種含鐵蛋白,如血液中的轉(zhuǎn)鐵蛋白、分泌物中的乳鐵蛋白以及細(xì)胞內(nèi)的鐵蛋白,包括多殺性巴氏桿菌在內(nèi)的絕大多數(shù)細(xì)菌物種形成了一些從宿主攝取含鐵蛋白的機(jī)制,即利用細(xì)菌編碼的多個外膜蛋白進(jìn)行含鐵蛋白的攝取。其中細(xì)菌的轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白(Transferrin binding protein,Tbp)能夠調(diào)節(jié)細(xì)菌從宿主攝取轉(zhuǎn)鐵蛋白,通常包含Tbp A和Tbp B兩個蛋白。本實(shí)驗(yàn)室分離的多殺性巴氏桿菌HB01株,經(jīng)全基因組測序證明僅有Tbp A蛋白,缺乏Tbp B蛋白,Tbp A蛋白構(gòu)成Pm的外膜蛋白。本研究將多殺性巴氏桿菌HB01株的tbp A基因片段克隆表達(dá),將表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠后驗(yàn)證其在小鼠水平上的保護(hù)力。并將其與副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)和傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的Tbp A蛋白進(jìn)行了交叉免疫保護(hù)力的測定,為研制預(yù)防巴氏桿菌科疾病的亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下:1.Pm-Tbp A、HPS-Tbp A、APP-Tbp A蛋白的克隆表達(dá)參照本實(shí)驗(yàn)組測序的HB01多殺性巴氏桿菌基因組設(shè)計Pm-tbp A的上下游引物,根據(jù)副豬嗜血桿菌SH0165基因組、傳染性胸膜肺炎放線桿菌JL01的基因組分別設(shè)計HPS-tbp A、APP-tbp A基因的引物,以HB01、SH0165、APP4074細(xì)菌基因組為模板PCR分別擴(kuò)增tbp A基因,重組構(gòu)建p ET-Pm-tbp A、p ET-HPS-tbp A、p ET-APP-tbp A原核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化到BL21中進(jìn)行表達(dá),在37℃條件下,終濃度為0.8mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3h,SDS-PAGE驗(yàn)證蛋白成功獲得表達(dá)。大量表達(dá)、純化三種蛋白,最終得到Pm-Tbp A蛋白濃度為1.2mg/m L,HPS-Tbp A蛋白濃度0.8mg/m L,APP-Tbp A蛋白濃度為0.75mg/m L。2.Pm-Tbp A蛋白對小鼠免疫原性評價用100μg/200μL Pm-Tbp A蛋白免疫小鼠,另設(shè)200μL PBS免疫對照組。二免后14d,用5LD50的HB01攻毒,15h后測定肺臟和血液的載菌量,結(jié)果顯示免疫組肺臟、血液含菌量分別為107 CFU/g、2×107CFU/ml,對照組肺臟、血液含菌量分別為2×108CFU/g、108CFU/ml,免疫組與對照組相比小鼠組織(肺臟、血液)載菌量分別下降了20倍和5倍。另按此免疫方案進(jìn)行Pm-Tbp A蛋白的免疫保護(hù)力測定,結(jié)果顯示,該蛋白針對小鼠免疫保護(hù)力為70%,表明Pm-Tbp A蛋白具有一定的免疫原性。3.三種細(xì)菌的Tbp A蛋白免疫小鼠后的交叉免疫保護(hù)力試驗(yàn)將Pm-Tbp A、HPS-Tbp A、APP-Tbp A蛋白分別免疫三組小鼠依次為A/B/C、D/E/F、G/H/I組,J/K/L三組為PBS空白對照組。二免后14d,A、D、G、J組用5LD50的HB01攻毒,B、E、H、K組用5LD50的SH0165攻毒,C、F、I、L組用5LD50的APP4074攻毒,觀察72h,記錄臨床癥狀和死亡數(shù)目。取病變部位進(jìn)行病理學(xué)觀察分析,動物實(shí)驗(yàn)過程中分別在一免后0、14、28d尾靜脈采血,檢測抗體水平。結(jié)果表明:三個不同細(xì)菌來源的Tbp A蛋白對各自宿主菌的保護(hù)率均為67%,HPS-Tbp A、APP-Tbp A蛋白免疫組相互間交叉保護(hù)率均為50%,對HB01的保護(hù)力為16.7%和33%,Pm-Tbp A提供給HPS和APP的保護(hù)力為16.7%。肺部組織外觀觀察顯示,免疫組存活的小鼠肺部輕微水腫、出血現(xiàn)象較輕,而對照組出現(xiàn)了嚴(yán)重的出血水腫現(xiàn)象;病理切片觀察對照組肺泡間隔破裂出血嚴(yán)重,免疫組肺泡損傷較小,僅有輕微的充血現(xiàn)象。這些結(jié)果證明三種蛋白具有不同水平的交叉免疫保護(hù)力。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61

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