本文關(guān)鍵詞：胞外鈣離子對(duì)豬BMSCs增殖和成脂分化的影響及作用機(jī)制

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【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一種多能干細(xì)胞,可向肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化,從而影響動(dòng)物體內(nèi)肌肉和脂肪的組成。因此,研究BMSCs的增殖和成脂分化對(duì)于調(diào)控動(dòng)物不同部位脂肪沉積、提高肉品質(zhì)具有重要的意義。Ca~(2+)是普遍存在于細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)物質(zhì),對(duì)細(xì)胞的增殖和脂肪生成具有重要的調(diào)控作用。然而,胞外鈣離子([Ca~(2+)]_o)對(duì)豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(pBMSCs)增殖和成脂分化的影響及其作用機(jī)制還不清楚。首先,我們采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了[Ca~(2+)]_o對(duì)pBMSCs成脂分化過程中不同時(shí)間細(xì)胞膜上鈣離子通道,包括L型電壓門控鈣通道(L-VGCC)亞型α/δ1(CACNA2D1)、鈣釋放激活鈣通道調(diào)控分子1(Orai1)、瞬時(shí)受體電位通道香草素受體亞型1(TRPV1),以及鈣敏感受體(CaSR)基因mRNA表達(dá)的影響。其次,我們采用CCK-8試劑盒、流式細(xì)胞分析、熒光定量PCR及Western blot等方法分別檢測(cè)了[Ca~(2+)]_o和/或nifedipine(L-VGCC阻斷劑)、NPS2143(CaSR阻斷劑)、U0126(ERK通路阻斷劑)對(duì)pBMSCs增殖過程中的細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞周期分布、胞內(nèi)鈣離子([Ca~(2+)]_i)濃度以及增殖相關(guān)基因、CaSR和ERK表達(dá)的影響,揭示了[Ca~(2+)]_o對(duì)pBMSCs增殖的影響及作用機(jī)制。最后,我們研究了[Ca~(2+)]_o對(duì)pBMSCs成脂分化和葡萄糖吸收的影響及其信號(hào)通路。采用油紅O染色、TG濃度檢測(cè)研究了[Ca~(2+)]_o和/或nifedipine、NPS2143、BAPTA-AM([Ca~(2+)]_i螯合劑)、KN-93(Ca MKII阻斷劑)、Wortmannin(PI3K通路阻斷劑)對(duì)pBMSCs成脂分化10天細(xì)胞聚酯的影響;通過Western blot進(jìn)一步研究了[Ca~(2+)]_o和各阻斷劑對(duì)pBMSCs成脂相關(guān)基因(PPARγ、CEBPα、aP2)、CaMKII、PI3K/Akt及其下游FoxO1和AS160表達(dá)的影響。此外,我們還通過葡萄糖檢測(cè)試劑盒、2-NBDG熒光葡萄糖吸收試劑盒、Western blot等方法研究了[Ca~(2+)]_o對(duì)pBMSCs成脂過程中葡萄糖消耗及吸收、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT4)表達(dá)與轉(zhuǎn)位的影響及調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果如下:1、在pBMSCs成脂分化第5天,4 mM[Ca~(2+)]_o極顯著促進(jìn)細(xì)胞膜上鈣離子通道(CACN2D1、Orai1、TRPV1)以及CaSR基因的mRNA表達(dá),提示[Ca~(2+)]_o及相關(guān)的細(xì)胞膜上的鈣離子通道、CaSR可能在pBMSCs成脂分化的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。2、[Ca~(2+)]_o劑量依賴性促進(jìn)pBMSCs增殖,且[Ca~(2+)]_o顯著促進(jìn)pBMSCs增殖過程中CaSR的mRNA和蛋白表達(dá);[Ca~(2+)]_o能夠升高pBMSCs增殖過程中[Ca~(2+)]_i濃度,促進(jìn)pBMSCs增殖過程中S期的細(xì)胞分布比例和細(xì)胞增殖指數(shù)(PI),同時(shí)抑制G0/G1期細(xì)胞分布比例;[Ca~(2+)]_o能夠促進(jìn)pBMSCs促增殖相關(guān)基因(cyclinA2/D1/D3/E2、PCNA)的mRNA和/或蛋白表達(dá),同時(shí)抑制p21基因的mRNA和蛋白表達(dá);此外,[Ca~(2+)]_o能夠促進(jìn)pBMSCs增殖過程中ERK1/2蛋白磷酸化;而阻斷CaSR或抑制ERK1/2信號(hào)通路均能夠逆轉(zhuǎn)[Ca~(2+)]_o促進(jìn)pBMSCs增殖及ERK通路激活的效果。以上結(jié)果提示,[Ca~(2+)]_o通過激活細(xì)胞膜上CaSR,提高胞內(nèi)鈣離子濃度,激活胞內(nèi)ERK信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)pBMSCs的增殖。3、[Ca~(2+)]_o顯著升高pBMSCs成脂過程中[Ca~(2+)]_i的濃度,促進(jìn)胞內(nèi)TG含量及成脂相關(guān)基因PPARγ、CEBPα、aP2的蛋白表達(dá);抑制VGCC和CaSR可阻斷[Ca~(2+)]_o對(duì)[Ca~(2+)]_i的升高作用;同時(shí),[Ca~(2+)]_o顯著促進(jìn)CaMKII、PI3K/Akt及其下游FoxO1的磷酸化;nifedipine、NPS2143、BAPTA-AM、KN-93、Wortmannin均能夠逆轉(zhuǎn)[Ca~(2+)]_o對(duì)pBMSCs成脂分化以及CaMKII、PI3K/Akt和FoxO1磷酸化的促進(jìn)作用。以上結(jié)果提示,[Ca~(2+)]_o通過VGCC和CaSR促進(jìn)[Ca~(2+)]_i的升高,進(jìn)而激活CaMKII-PI3K/Akt-Fox O1通路,從而促進(jìn)pBMSCs的成脂分化。4、[Ca~(2+)]_o顯著促進(jìn)細(xì)胞GLUT4的表達(dá)和轉(zhuǎn)位、加強(qiáng)細(xì)胞的葡萄糖消耗和吸收,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞CaMKII、PI3K/Akt和AS160的磷酸化;而nifedipine、BAPTA-AM、KN-93、Wortmannin均能逆轉(zhuǎn)[Ca~(2+)]_o對(duì)pBMSCs成脂過程中GLUT4表達(dá)及轉(zhuǎn)位、葡萄糖吸收與消耗的促進(jìn)作用。上述結(jié)果提示,[Ca~(2+)]_o通過VGCC促進(jìn)[Ca~(2+)]_i的升高,進(jìn)而激活CaMKII-PI3K/Akt-AS160通路,從而促進(jìn)pBMSCs成脂過程中GLUT4的轉(zhuǎn)位及葡萄糖的吸收。綜上,[Ca~(2+)]_o顯著促進(jìn)pBMSCs成脂過程中細(xì)胞膜鈣離子通道及CaSR的表達(dá);[Ca~(2+)]_o通過激活pBMSCs細(xì)胞膜上的CaSR使[Ca~(2+)]_i濃度升高,進(jìn)而激活胞內(nèi)ERK通路,促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程與細(xì)胞的增殖;在pBMSCs成脂分化中,[Ca~(2+)]_o可通過VGCC或激活CaSR升高[Ca~(2+)]_i濃度,進(jìn)而激活CaMKII-PI3K/Akt-FoxO1/AS60信號(hào)通路,最終促進(jìn)pBMSCs成脂分化和葡萄糖吸收。以上研究結(jié)果揭示了胞外鈣離子對(duì)豬BMSCs增殖和成脂分化的影響及其作用機(jī)制,同時(shí)為營(yíng)養(yǎng)調(diào)控動(dòng)物脂肪沉積、提高肉品質(zhì)提供重要的科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S828

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells[J];Cell Research;2002年01期

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本文編號(hào)：1161549