本文關(guān)鍵詞：禽腺病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

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【摘要】：禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAd V)是無(wú)囊膜、線(xiàn)性雙股DNA病毒,屬于腺病毒科、禽腺病毒屬成員。該病毒可感染雞、火雞及其他禽類(lèi)。FAd V可致雞發(fā)生包涵體肝炎(Inclusion body hepatitis,IBH)、心包積水綜合征(Hydropericardium syndrome,HPS)和肌胃糜爛(Gizzard erosions,GE)等疾病。禽腺病毒屬中包含8個(gè)種,分為禽腺病毒A~E、鵝腺病毒A、隼腺病毒A、及火雞腺病毒B。蛋雞和肉雞均可感染該病毒,通常3~5周齡較為易感。該病常與禽類(lèi)其他病原混合感染,感染雞只可繼發(fā)再生障礙性貧血、肝炎及產(chǎn)蛋量下降等。FAd V呈世界性分布,病毒可經(jīng)糞-口途徑水平傳播,也可垂直傳播,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究建立FAd V熒光定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)方法,為FAdV的快速檢測(cè)提供技術(shù)手段,同時(shí)也為疫病凈化提供技術(shù)平臺(tái),對(duì)促進(jìn)養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。對(duì)Gen Bank發(fā)表的FAdV-A、B、C、D和E種參考毒株的Hexon基因序列進(jìn)行多重比對(duì),選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)兼并引物,使檢測(cè)引物具有FAdV各個(gè)種的種間通用性。應(yīng)用常規(guī)PCR方法從FAdV-D基因組中擴(kuò)增Hexon-1基因片段,大小為191bp,將此片段克隆到p MD18-T載體,制備標(biāo)準(zhǔn)品,以標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行real-time PCR的擴(kuò)增,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)品在質(zhì)粒濃度為1×1010拷貝/μL~1×104拷貝/μL檢測(cè)范圍內(nèi)的錯(cuò)誤率為0.0599,擴(kuò)增效率為1.904,斜率為-3.575,具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品1×1010拷貝/μL~1×104拷貝/μL濃度范圍進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增,其中標(biāo)準(zhǔn)品的敏感性為1×103拷貝/μL。并對(duì)其分別進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù),組內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)分別為0.22%、0.24%、0.11%、0.27%、0.18%、0.35%和0.37%;組間重復(fù)變異系數(shù)(CV%)分別為0.50%、0.86%、0.73%、1.32%、1.06%、0.56%和0.78%。因此本研究建立FAd V熒光定量PCR檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性及穩(wěn)定性。應(yīng)用建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法,分別對(duì)禽腺病毒FAdV-D種及FAd V-C種的最小檢出滴度進(jìn)行測(cè)定,對(duì)FAd V-D和FAd V-C種的檢測(cè)下限均為102TCID50/ml,是常規(guī)PCR檢測(cè)方法的10倍。說(shuō)明本研究建立的檢測(cè)FAd V熒光定量PCR的方法具有較好的敏感性。將禽腺病毒FAd V-D毒株以相同劑量和滴度(100EID50)分別以卵黃囊(6.5日齡)、尿囊膜(9日齡)、尿囊腔(9日齡)途徑接種SPF雞胚,采集雞胚的組織包括腦、心臟、腸、肺臟、胸腺、肝臟、腺胃、腎臟、脾臟、法氏囊以及雞胚尿囊液和雞胚尿囊膜。結(jié)果表明不同接種途徑對(duì)FAd V-D在SPF雞胚中的增殖影響較大,卵黃囊途徑接種SPF雞胚,雞胚尿囊膜及尿囊液中DNA拷貝數(shù)高于其他兩種接種途徑,其中經(jīng)卵黃囊、尿囊膜、尿囊腔途徑接種SPF雞胚,雞胚尿囊膜中DNA拷貝數(shù)分別為1.32×108拷貝/mg、2.89×105拷貝/mg及9.07×104拷貝/mg,接胚尿囊液中DNA拷貝數(shù)分別為4.99×104拷貝/mg、3.28×104拷貝/mg及1.32×104拷貝/mg。因此,FAdV-D在SPF雞胚中最適接種途徑為卵黃囊接種,病毒在雞胚尿囊膜和尿囊液中良好增殖,可收獲尿囊膜及尿囊液作為病毒儲(chǔ)液。病毒在雞胚肝組織中DNA拷貝數(shù)最高,為4.67×108拷貝/mg。此外,用Günes等已報(bào)道的real-time PCR檢測(cè)方法對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行符合性檢驗(yàn),與本研究建立的real-time PCR方法檢測(cè)結(jié)果相比,病毒在雞胚組織中的分布和組織中的病毒載量具有良好的一致性。FAd V-D感染1日齡SPF雞,于攻毒后每4天采集口咽和泄殖腔拭子,使用本研究建立的FAd V real-time PCR檢測(cè)方法檢測(cè)感染雞只排毒情況,持續(xù)檢測(cè)至攻毒后72d。結(jié)果表明,感染雞只于攻毒后4d開(kāi)始排毒,攻毒后72d仍可從感染雞只口咽和泄殖腔拭子中檢測(cè)到病毒,經(jīng)口咽拭子檢出率為7/10(70%),經(jīng)泄殖腔拭子檢出率為8/10(80%)。應(yīng)用常規(guī)PCR檢測(cè)方法對(duì)上述樣品進(jìn)行平行檢測(cè),感染雞只于攻毒后4d開(kāi)始排毒,至攻毒后72d,雞只口咽和泄殖腔拭子均檢測(cè)不到病毒。在攻毒后第8天,感染FAdV-D組的雞群中有3只雞發(fā)病嚴(yán)重、瀕死,將3只瀕死雞安樂(lè)死處理,采集組織樣品,real-time PCR檢測(cè)病毒在感染雞體組織分布情況。結(jié)果表明,感染雞只各組織臟器中均有病毒存在,說(shuō)明FAd V為泛嗜性病毒,但主要嗜性組織為腸和肝臟,在直腸中檢測(cè)到病毒基因組拷貝數(shù)最高,在脾臟中病毒基因組拷貝數(shù)最低。分別使用本研究建立的real-time PCR和常規(guī)PCR方法對(duì)收集到的我國(guó)10個(gè)省份143份疑似FAd V感染雞的組織病料進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)real-time PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性率為63.6%(91/143),常規(guī)PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性率為40.5%(58/143),說(shuō)明本研究建立的FAdV real-time PCR檢測(cè)方法在臨床病料檢測(cè)上具有良好的敏感性。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
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本文編號(hào)：1145454