本文關(guān)鍵詞：黑龍江省部分地區(qū)奶牛三種重要人獸共患原蟲的分子鑒定及其遺傳學(xué)特征

  更多相關(guān)文章： 奶牛 腸道原蟲 基因分型 多位點(diǎn)序列分型 人獸共患病

【摘要】：隱孢子蟲(Cryptosporidium spp.)、畢氏腸微孢子蟲(Enterocytozoon bieneusi)和芽囊原蟲(Blastocystis spp.)是三種重要的人獸共患機(jī)會性腸道原蟲,感染呈世界分布。其卵囊、孢子或者包囊在環(huán)境中廣泛存在,由其引起的隱孢子蟲病、微孢子蟲病和芽囊原蟲病嚴(yán)重危害著人和動(dòng)物的健康,阻礙畜牧業(yè)的發(fā)展。黑龍江省是我國奶牛養(yǎng)殖重地,但有關(guān)這三種原蟲在黑龍江奶牛中的感染率、蟲種或基因型分布情況以及遺傳學(xué)特征鮮有報(bào)道。本研究首先采用特異性巢式PCR結(jié)合測序的方法,對黑龍江省哈爾濱市、齊齊哈爾市和大慶市三個(gè)規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場的三種原蟲的感染率、蟲種/基因型和亞型進(jìn)行確定。結(jié)果顯示,隱孢子蟲在黑龍江奶牛中的總感染率(24.7%,130/526;95%confidence interval(CI),0.205至0.290)顯著高于芽囊原蟲(10.3%,54/526;95%CI,0.075至0.130)和畢氏腸微孢子蟲(5.9%,31/526;95%CI,0.038至0.080)(p0.01),為優(yōu)勢感染蟲種。基于隱孢子蟲(small subunit ribosomal RNA,SSU r RNA)基因的序列分析,在130個(gè)隱孢子蟲PCR陽性樣本中共鑒定出了5個(gè)蟲種/基因型,分別是微小隱孢子蟲(C.parvum,87/130)、牛隱孢子蟲(C.bovis,28/130)、芮氏隱孢子蟲(C.ryanae,5/130)、安氏隱孢子蟲(C.andersoni,2/130)和似豬隱孢子蟲基因型(C.suis-like genotype,2/130)。此外,還在哈爾濱一頭斷奶前犢牛中鑒定出微小隱孢子蟲和牛隱孢子蟲的混合感染(1/130)。微小隱孢子蟲和牛隱孢子蟲是黑龍江奶牛隱孢子蟲優(yōu)勢蟲種。微小隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲為人獸共患蟲種�；趃p60(60 k Da glycoprotein gene)基因的DNA序列多態(tài)性,在87個(gè)微小隱孢子蟲分離株中鑒定出了2個(gè)具有潛在致病力差異的IId亞型家族亞型,分別為IId A15G1(24/87)和IId A20G1(48/87)。這兩個(gè)亞型曾在多個(gè)國家的人和動(dòng)物中報(bào)道,因而具有重要的人獸共患重要性。其中,IId A20G1為首次在中國奶牛中發(fā)現(xiàn),而IId A15G1為首次在黑龍江省報(bào)道。基于畢氏腸微孢子蟲核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)的序列分析,在31個(gè)畢氏腸微孢子蟲PCR陽性樣本中鑒定出了11個(gè)基因型,包括6個(gè)已知的基因型(BEB4,CS-4,Ebp C,G,I,J)和5個(gè)新基因型(NECA1至NECA5)。在基于ITS位點(diǎn)的系統(tǒng)進(jìn)化分析中,本研究鑒定的5個(gè)新基因型和已知基因型G、CS-4和Ebp C位于具有人獸共患可能性的進(jìn)化組Group 1中;而基因型BEB4、I和J則分布于可能具有宿主特異性的進(jìn)化組Group 2中。其中,已知基因型BEB4、CS-4、Ebp C、G、I和J均為人獸共患基因型。基于芽囊原蟲SSU r RNA基因的序列分析,在54個(gè)芽囊原蟲PCR陽性樣本中鑒定出4個(gè)已知亞型,分別為ST4(2/54)、ST5(1/54)、ST10(41/54)、ST14(9/54)和一個(gè)新亞型ST18(1/54)。優(yōu)勢亞型為具有宿主特異性的ST10。其中,ST4和ST5為人獸共患亞型。本研究在中國首次報(bào)道奶牛芽囊原蟲的感染率和亞型分布特征。本研究運(yùn)用多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)對部分微小隱孢子蟲分離株和畢氏腸微孢子蟲分離株進(jìn)行亞型分型。共選取10個(gè)不同亞型(IId A15G1,n=5和IId A20G1,n=5)的C.parvum分離株在5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(Actin,DZ-HRGP,HSP70,ML1和ML2)進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果顯示這些分離株只在DZ-HRGP、HSP70、ML1和ML2位點(diǎn)得到有效擴(kuò)增,且核苷酸序列在各個(gè)位點(diǎn)上完全一致。因此,可初步斷定微小隱孢子蟲在黑龍江省哈爾濱市和齊齊哈爾市分別呈地方性流行。后期還需要在其它多態(tài)性位點(diǎn),甚至基因組水平上對這兩個(gè)亞型的群體進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究,以確定其致病力的差異及群體結(jié)構(gòu)特征。本研究還運(yùn)用已經(jīng)建立的MLST分型方法,對另外10個(gè)畢氏腸微孢子蟲陽性DNA樣本進(jìn)行微衛(wèi)星(MS1,MS3,MS7)和小衛(wèi)星(MS4)遺傳位點(diǎn)擴(kuò)增。結(jié)果只有4個(gè)ITS基因型為CS4、BEB4和J的分離株在這些位點(diǎn)上得到有效擴(kuò)增并顯示出遺傳多樣性。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,這些樣本在不同遺傳位點(diǎn)上均和經(jīng)常在人中報(bào)道的亞型具有相近的遺傳學(xué)關(guān)系。該研究結(jié)果暴露了ITS分型能力的不足,并驗(yàn)證了位于Group 2中的部分ITS基因型(BEB4和J)宿主范圍已經(jīng)擴(kuò)大,并能感染人,因此同樣具有人獸共患重要性。因此,在今后的研究中應(yīng)使用具有高分辨率的MLST分型方法來評估新分離株的人獸共患可能性、追蹤感染來源及闡明傳播機(jī)制等科學(xué)問題。最后,用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對三種原蟲中感染率較高的隱孢子蟲進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)因素的分析。在單因素分析中,通過計(jì)算比值比OR(odds ratio)及其95%CI(confidence interval),發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)模式(室內(nèi)密集圈養(yǎng))、年齡(幼齡動(dòng)物)、季節(jié)(春季和秋季)和養(yǎng)牛場的使用時(shí)間(10年)這4個(gè)因素均能增加奶牛患隱孢子蟲病的風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述,本研究對黑龍江省奶牛三種重要的腸道原蟲進(jìn)行了感染率、蟲種、基因型或亞型的分子鑒定并對其人獸共患可能性進(jìn)行了評價(jià),確定了齊齊哈爾奶牛場犢牛腹瀉的病因并分析了引起隱孢子蟲暴發(fā)流行的原因,明確了奶牛隱孢子蟲病在該地區(qū)的傳播動(dòng)態(tài)和特征。本研究還運(yùn)用MLST分型工具對部分隱孢子蟲蟲種和畢氏腸微孢子蟲基因型在多個(gè)基因位點(diǎn)上進(jìn)行了分子鑒定,獲得了更為豐富的遺傳學(xué)信息。另外,本研究首次對黑龍江省奶牛隱孢子蟲病進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)因素評估,明確了科學(xué)的養(yǎng)殖模式和良好的衛(wèi)生保健措施在控制隱孢子蟲病人獸傳播中的重要作用。
【關(guān)鍵詞】：奶牛 腸道原蟲 基因分型 多位點(diǎn)序列分型 人獸共患病
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 引言12-22
• 1.1 隱孢子蟲基因分型和亞型分型13-15
• 1.2 隱孢子蟲多位點(diǎn)序列分型和群體遺傳學(xué)15-17
• 1.3 隱孢子蟲比較基因組學(xué)17
• 1.4 畢氏腸微孢子蟲的基因分型17-18
• 1.5 畢氏腸微孢子蟲多位點(diǎn)序列分型和群體遺傳學(xué)18-20
• 1.6 芽囊原蟲基因分型20
• 1.7 研究目的與意義20-22
• 2 材料和方法22-28
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 臨床糞便樣本采集和流行病學(xué)資料收集22
• 2.1.2 主要試劑22-23
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備23
• 2.2 方法23-28
• 2.2.1 DNA提取23
• 2.2.2 三種原蟲蟲種或基因型的鑒定23-24
• 2.2.3 微小隱孢子蟲亞型分型和多位點(diǎn)序列分型24-25
• 2.2.4 畢氏腸微孢子蟲多位點(diǎn)序列分型25-26
• 2.2.5 PCR產(chǎn)物測序26
• 2.2.6 測序結(jié)果分析26
• 2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和風(fēng)險(xiǎn)因素分析26-27
• 2.2.8 系統(tǒng)進(jìn)化分析27-28
• 3 結(jié)果28-43
• 3.1 不同群體奶牛三種腸道原蟲的感染情況28-31
• 3.2 隱孢子蟲的蟲種鑒定31-32
• 3.3 微小隱孢子蟲亞型鑒定及多位點(diǎn)序列分型結(jié)果32-33
• 3.4 畢氏腸微孢子蟲基因型鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果33-35
• 3.5 畢氏腸微孢子蟲多位點(diǎn)序列分型及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果35-40
• 3.6 芽囊原蟲的基因型鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析40
• 3.7 影響隱孢子蟲感染率的風(fēng)險(xiǎn)因素40-43
• 4 討論43-50
• 4.1 黑龍江省奶牛隱孢子蟲的感染情況和蟲種分布43-44
• 4.2 微小隱孢子蟲的亞型分布和多位點(diǎn)序列分型44-45
• 4.3 畢氏腸微孢子蟲的感染情況、基因型分布及多位點(diǎn)序列分型45-47
• 4.4 芽囊原蟲的感染情況和基因型分布47-48
• 4.5 隱孢子蟲感染的風(fēng)險(xiǎn)因素48-50
• 5 結(jié)論50-51
• 致謝51-52
• 參考文獻(xiàn)52-66
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文66

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