本文關(guān)鍵詞：禽痘病毒對雛雞皮膚病變的演化及MAPKs通路研究

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【摘要】：禽痘是由禽痘病毒(Avian poxvirus,APVs)引起的各個年齡段家禽、鳥類發(fā)病以出痘為主要特征的一種傳染性疾病。病毒感染后能夠?qū)е滤拗鞯乃劳?同時容易繼發(fā)感染,不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶了極大地經(jīng)濟損失,同時對野生鳥類,尤其是瀕危鳥類造成極大威脅。本研究通過建立APVs感染雞動物模型,運用病理學方法,比較了雞源和野生山斑鳩源APVs的致病性,觀察了痘疹的發(fā)生發(fā)展過程;利用熒光定量PCR技術(shù),測定了感染雞皮膚組織相關(guān)因子的表達量,試圖探索APVs致皮膚組織增生的機制。1.APV-P4b多克隆抗體的制備本實驗以APVs的DNA為模板,利用PCR方法擴增P4b基因,克隆至pET42b載體上,經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定,測序分析正確后,獲得重組質(zhì)粒pET42b-APV-P4b,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta中,在IPTG終濃度0.1mmol/L和37℃條件下誘導6h,外源基因獲得高效表達。通過Ni-NTA對蛋白進行純化,純化后的APV-P4b蛋白免疫家兔,經(jīng)三次免疫后選擇血清效價最高的兔子,取全血,分離得到APV-P4b多克隆抗體,經(jīng)免疫組織化學方法檢測,結(jié)果表明多克隆抗體可特異性識別APVs。2.雛雞感染模型的建立用來源于雞和野生山斑鳩的APVs,分別命名為HN-1210毒株和HN-1308毒株,分別感染10日齡白來航蛋雞,在感染后6h、12h、24h、48h、72h、120h和168h剖殺取皮膚組織,通過組織病理學觀察APVs感染皮膚后痘疹的發(fā)生發(fā)展過程及APVs在皮膚組織中的分布;利用RT-qPCR技術(shù)檢測APVs感染后皮膚組織中EGFR、Raf和Cyclin D1表達量的動態(tài)變化,探討APVs引起皮膚上皮細胞增生的機制。臨床癥狀結(jié)果發(fā)現(xiàn),HN-1210毒株感染后2d出現(xiàn)少量白色痘疹,感染3d后痘疹數(shù)量明顯增多,感染5d后痘疹出現(xiàn)破潰的現(xiàn)象,形成痘痂同時伴有出血,感染后7d發(fā)生痘痂脫落。HN-1308毒株感染后5d在接種部位出現(xiàn)少量暗紅色的痘疹,感染后7d未發(fā)現(xiàn)病變有進一步加重的現(xiàn)象。組織病理學觀察可見,HN-1210感染后2d毛囊和表皮層的上皮細胞增生,細胞數(shù)量明顯增多,感染后3d毛囊上皮細胞出現(xiàn)水泡變性,在細胞質(zhì)中可以觀察到有嗜酸性包涵體的存在,而表皮層無水泡變性及嗜酸性包涵體出現(xiàn),感染5d后,表皮層上皮細胞出現(xiàn)水泡變性及細胞質(zhì)中觀察到嗜酸性包涵體,同時一些區(qū)域的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)的完整性破壞,伴有明顯的出血現(xiàn)象,感染7d后表皮層與真皮層脫離,同時伴有大面積的出血。HN-1308毒株感染5d和7d后,在真皮層以毛囊為中心有大量的淋巴細胞增生,伴隨有毛囊炎的發(fā)生,毛囊結(jié)構(gòu)完全消失,被嗜伊紅性均質(zhì)物所取代,表皮層組織結(jié)構(gòu)完整,未見有增生現(xiàn)象。用免疫組織化學定位病毒抗原,結(jié)果顯示:陽性信號存在于毛囊和上皮細胞的細胞質(zhì),提示APVs感染后主要存在于上皮細胞的細胞質(zhì)中。熒光定量檢測皮膚中EGFR介導的增生信號通路相關(guān)因子的表達量,結(jié)果顯示HN-1210毒株感染后EGFR的表達量在1d到5d處于上調(diào)狀態(tài),感染后3d達到最高值;Raf表達量在1d到7d均處于上調(diào)狀態(tài);Cyclin D1表達量在2d到7d處于上調(diào)的狀態(tài),可見EGFR信號被激活后經(jīng)由Ras-Raf-ERK/MAPK通路傳導入核,使Cyclin D1的表達量增加,縮短細胞周期,促進細胞增生。HN-1308毒株感染后EGFR表達量在24h有上升的趨勢,之后趨于正常水平,Raf和Cyclin D1在感染過程中表達量處于正常水平,說明EGFR介導的增生通路未被激活。
【關(guān)鍵詞】：禽痘 痘疹 水泡變性 包涵體 增生 EGFR
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 縮略語表(Abbreviation)11-12
• 前言12-20
• 1. 禽痘病毒的致病性及疾病診斷12-15
• 1.1 宿主13
• 1.2 傳播途徑13
• 1.3 臨床癥狀13-14
• 1.4 實驗室診斷14-15
• 2. APVs分子生物學特性15-17
• 2.1 APVs基因組結(jié)構(gòu)15
• 2.2 APVs的分類15-16
• 2.3 APVs系統(tǒng)發(fā)育進化分析16-17
• 3 細胞增生信號通路研究17-20
• 3.1 EGF和EGFR17-18
• 3.2 MAPK信號通路18
• 3.3 重要的細胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D118-20
• 研究目的及意義20-21
• 材料與方法21-35
• 1 試驗材料21-25
• 1.1 主要儀器設備21
• 1.2 主要試劑21-22
• 1.3 主要試劑的配制22-23
• 1.4 病毒來源23-24
• 1.5 實驗動物24
• 1.6 實驗所用引物24-25
• 2 試驗方法25-35
• 2.1 病毒的增殖25
• 2.2 EID50的測定25
• 2.3 APV-P4b蛋白的表達與純化25-30
• 2.4 多克隆抗體的制備30
• 2.5 免疫組織化學技術(shù)檢測多克隆抗體30-31
• 2.6 動物試驗31
• 2.7 不同組織中病毒的檢測—PCR31
• 2.8 皮膚組織病理學變化動態(tài)觀察31-32
• 2.9 APVs在皮膚組織中的分布與定位--免疫組織化學方法32
• 2.10 皮膚組織中EGFR、RAF、Cyclin D1基因表達量的測定  實時熒光定量PCR32-35
• 結(jié)果35-55
• 1. APV-P4b蛋白的表達與純化35-37
• 1.1 PCR擴增目的片段35
• 1.2 原核表達蛋白APV-P4b的SDS-PAGE鑒定35-37
• 2 多克隆抗體的制備37-38
• 2.1 免疫兔血清抗體效價的檢測37
• 2.2 免疫組化檢測多克隆抗體結(jié)果37-38
• 3 雞胚接種結(jié)果38-41
• 3.1 CAM組織學觀察結(jié)果38-40
• 3.2 EID50測定結(jié)果40-41
• 4.動物實驗結(jié)果41-55
• 4.1 不同組織中病毒檢測--PCR檢測結(jié)果41
• 4.2 HN-1210和HN-1308株APV感染雛雞的臨床表現(xiàn)與眼觀病變41-44
• 4.3 HN-1210和HN-1308株APV感染雛雞的組織病理學變化結(jié)果44-48
• 4.4 APV在皮膚組織中的分布  免疫組織化學技術(shù)檢測結(jié)果48-50
• 4.5 皮膚組織中EGFR、Raf、CyclinD1的mRNA表達量測定  RT-qPCR檢測結(jié)果50-55
• 討論55-58
• 1 HN-1210和HN-1308株APV的增殖55
• 2 動物模型55-56
• 3 免疫組織化學檢測56-57
• 4 EGF/EGFR介導的信號通路在APVs感染過程中的作用57-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻59-65
• 致謝65

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本文編號：1122321