本文關鍵詞：外源谷胱甘肽促進牛體外受精胚胎發(fā)育的機制

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【摘要】：在胚胎的體外培養(yǎng)過程中會有氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的產生,正常情況下胞內產生和清除ROS的量會維持平衡狀態(tài),然而這種狀態(tài)一旦遭到破壞就會使胞內積累過多的ROS,過量的ROS會損傷細胞,影響胚胎的發(fā)育能力。抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione,GSH)能清除ROS,由ROS帶來的氧化應激不能損傷到胚胎,最終對胚胎的體外發(fā)育和胚胎質量都能有所提高。然而,外源GSH如何進入體外培養(yǎng)的胚胎內,并有效清除ROS的機制并不清楚,因此本文采用胚胎工程、細胞生物學、分子生物學和轉錄組學方法揭示外源GSH的轉運及其對胞內ROS的作用機制,及GSH處理對胚胎轉錄組水平的影響,為胚胎體外生產效率的提高提供理論基礎。牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中添加3毫摩爾每升(mmol/L,mM)GSH后繼續(xù)培養(yǎng)到7天,分別統(tǒng)計各階段的胚胎發(fā)育率及囊胚總細胞數;同時,測定受精后8h、18h、24h和32h胚胎內的ROS和GSH含量。采用酶聯免疫測定受精后8h、18h、24h和32h胚胎中GSH運輸和再合成相關酶(GGT、GGT、5-OPase、GCLC、GCLM和GSS)的活性,及其在基因的mRNA表達水平。結果,GSH添加后,卵裂率及囊胚率明顯提高;細胞內ROS含量降低,GSH升高。此外,添加GSH后發(fā)現在受精32h時,GGT的mRNA表達量上升,GCLC和GSS的mRNA表達水平下降;在受精后18h時,GGCT的mRNA表達量下降,5-OPase和GCLM的表達量上升。與GSH轉運和再合成相關的4種酶的活性也發(fā)生了相應的改變。其中,在受精后18h,γ-GCS的活性顯著增高(P0.05),GGCT活性則顯著降低(P0.05);在受精后32h,GGT的活性顯著升高(P0.05),GSS的活性顯著降低(P0.05)。說明添加GSH能顯著提高體外胚胎發(fā)育能力。采用Illumina平臺對8-16細胞期和桑椹期的牛體外受精胚胎,進行測序;篩選出差異基因進行功能注釋和代謝途徑分析;采用定量PCR對十個基因的表達水平進行檢測,以驗證測序結果的準確性;在獲得的新轉錄本中挑選3組進行RNA和蛋白結構的預測。在對OOSP1,THAP9等10個基因的定量檢測、測序結果的質量評價(堿基錯誤率、Q20、Q30、GC含量)、reads與�；蚪M的比對及其在基因組的分布統(tǒng)計分析,均說明該測序結果準確、可靠。與已知的轉錄本相比,4個新轉錄本中均發(fā)現不同長度的新外顯子;預測的蛋白結構中除包含各自的保守結構域(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的催化結構域、MAD同源結構域)外,還發(fā)現2個新的蛋白結構域(低復雜區(qū)、dwarfins蛋白家族B結構域)。在培養(yǎng)液中添加GSH能導致胚胎轉錄譜的變化,顯著提高胚胎的體外發(fā)育能力。
【關鍵詞】：牛 谷胱甘肽 體外受精胚胎 抗氧化 轉錄組測序
【學位授予單位】：河北工程大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S823
【目錄】：

• 縮略詞（Abbreviation）5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-14
• 第一章 文獻綜述14-23
• 1.1 早期胚胎發(fā)育14-15
• 1.2 谷胱甘肽在胚胎發(fā)育中的作用15-16
• 1.3 轉錄組測序的研究現狀16
• 1.4 基因功能驗證及新轉錄本功能預測16-21
• 1.4.1 生物信息學分析17-18
• 1.4.2 分子生物學技術18-20
• 1.4.3 蛋白水平分析20
• 1.4.4 表型分析20-21
• 1.5 本研究的目的意義21-23
• 第二章 谷胱甘肽對分裂前胚胎發(fā)育的影響23-36
• 2.1 試驗材料23-24
• 2.1.1 試驗材料23
• 2.1.2 主要儀器和設備23-24
• 2.1.3 主要試劑和耗材24
• 2.2 實驗方法24-29
• 2.2.1 主要溶液的配制24-25
• 2.2.2 卵母細胞的采集和體外成熟培養(yǎng)25
• 2.2.3 體外受精25
• 2.2.4 體外培養(yǎng)25
• 2.2.5 囊胚總細胞數計算25-26
• 2.2.6 卵母細胞和合子內GSH、ROS含量的檢測26
• 2.2.7 qRT-PCR檢測基因表達情況26-28
• 2.2.8 與GSH轉運合成相關酶的活性測定28-29
• 2.3 實驗結果與分析29-33
• 2.3.1 谷胱甘肽對胚胎發(fā)育的影響29-30
• 2.3.2 對內源性GSH、ROS的影響30-31
• 2.3.3 對谷胱甘肽轉運合成相關基因的影響31-32
• 2.3.4 對谷胱甘肽轉運合成相關酶的影響32-33
• 2.4 討論33-36
• 第三章 轉錄組測序質量評估36-42
• 3.1 實驗材料36
• 3.1.1 實驗材料36
• 3.1.2 主要儀器和設備36
• 3.1.3 主要試劑和耗材36
• 3.2 實驗方法36-37
• 3.2.1 建庫測序36-37
• 3.2.2 測序質量的控制37
• 3.3 實驗結果與分析37-41
• 3.3.1 測序數據的質量情況匯總37-39
• 3.3.2 READS與參考基因組比對情況39-40
• 3.3.3 READS在參考基因組不同區(qū)域的分布情況40-41
• 3.4 討論41-42
• 第四章 新轉錄本的預測及定量PCR驗證42-49
• 4.1 實驗材料42
• 4.1.1 實驗材料42
• 4.1.2 主要儀器和設備42
• 4.1.3 主要試劑和耗材42
• 4.2 實驗方法42-44
• 4.2.1 新轉錄本的ORF預測和功能預測42-43
• 4.2.2 cDNA的樣品制備和定量檢測43
• 4.2.3 引物設計及定量驗證43-44
• 4.3 實驗結果與分析44-48
• 4.3.1 新轉錄本ORF預測44-45
• 4.3.2 功能結構域預測45-47
• 4.3.3 定量PCR檢測結果與轉錄組比較47-48
• 4.4 討論48-49
• 第五章 全文總結49-50
• 參考文獻50-55
• 致謝55-56
• 作者簡介56-57
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文57-58

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