本文關(guān)鍵詞：C1EIS基因?qū)﹄uESC向雄性生殖細(xì)胞分化的調(diào)控作用

  更多相關(guān)文章： 雞胚胎干細(xì)胞 雞胚精原干細(xì)胞 CRISPR/Cas9 C1EIS

【摘要】：胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell, ESC)向雄性生殖細(xì)胞的誘導(dǎo)分化受到許多內(nèi)源性分化因子和外源誘導(dǎo)因素的調(diào)控。其中視黃酸(Retinoic acid, RA)、骨形成蛋白4 (Bone morphogenetic protein 4, BMP4)等外源誘導(dǎo)培養(yǎng)與Sta8 DAZL等內(nèi)源基因調(diào)控形成復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同發(fā)揮關(guān)鍵作用。隨著對(duì)ESC向雄性生殖細(xì)分化機(jī)制的深入了解,發(fā)現(xiàn)存在新基因特異表達(dá),探索這些新基因功能對(duì)完善胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)體系,治療不孕不育疾病具有重要意義。本研究利用CRISPR/Cas9高效基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)在雞上基因敲除,探索精原干細(xì)胞特異表達(dá)基因C1EIS功能,為闡明生殖細(xì)胞發(fā)生及分化機(jī)制提供高效方法。本文主要研究如下：1前期通過RNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)C1EIS基因在ESC向SSC分化過程中,存在顯著差異表達(dá)。通過RT-PCR獲得如皋黃雞C1EIS基因編碼區(qū)并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：C1EIS基因(基因登錄號(hào)：XM_416004.2)編碼144個(gè)氨基酸,屬于不穩(wěn)定的脂溶蛋白。C1EIS蛋白無信號(hào)肽,主要在細(xì)胞核中表達(dá)。存在2個(gè)O-糖基化位點(diǎn)和1個(gè)N-糖基化位點(diǎn),可能含有磷酸化位點(diǎn)：二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋占45.14%,p轉(zhuǎn)角占4.17%,伸展片段占15.97,無規(guī)則卷曲占34.72%；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示雞C1EIS蛋白與綠頭鴨進(jìn)化關(guān)系密切,與牛等哺乳類動(dòng)物同源性較低。2設(shè)計(jì)3對(duì)特異sgRNA序列,構(gòu)建CRISPR/Cas9敲除載體。使用含1.7% DMSO培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)后轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9載體。利用菌液PCR, T7E1酶切和TA克隆測(cè)序檢測(cè)CRISPR/Cas9敲除載體活性。結(jié)果表明C1EIS基因存在2-3bp堿基缺失,突變效率為20%。CRISPR/Cas9技術(shù)能夠穩(wěn)定的在雞的細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)C1EIS基因突變。利用qPCR克隆C1EIS基因,連接pcDNA3.0過表達(dá)載體。利用EcoRI和Kpn I雙酶切獲得C1EIS條帶,表明pcDNA3.0-C1EIS過表達(dá)載體構(gòu)建成功。3分別將CRISPR/Cas9載體,pcDNA3.0-C1EIS過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染ESC,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后換RA誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)12天。采用形態(tài)學(xué)觀察、免疫化學(xué)檢測(cè)、流式細(xì)胞檢測(cè)和QRT-PCR等方法檢測(cè)C1EIS缺失與過表達(dá)對(duì)ESC向SSC分化的影響。結(jié)果表明C1EIS缺失的ESC與正常RA誘導(dǎo)組相比,第6天類胚體數(shù)目降低57%,且停止向SSC分化；第12天RA誘導(dǎo)組與過表達(dá)組形成類SSC, C1EIS敲除組無類SSC形成；細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)表明C1EIS缺失導(dǎo)致integrin α6、 integrin β1蛋白表達(dá)量低于正常RA誘導(dǎo)組；流式分選結(jié)果表明C1EIS缺失integrin a6、 integrin β1雙陽性細(xì)胞數(shù)為0.1%,對(duì)照組與過表達(dá)組為20.8%和19.7%。熒光定量PCR結(jié)果表明誘導(dǎo)4d后,C1EIS缺失組Sox2和Nanog基因表達(dá)量顯著高于正常RA誘導(dǎo)組51%和42%；誘導(dǎo)12d后,integrin α6和integrin β1基因表達(dá)量顯著低于正常RA誘導(dǎo)組72%和38%。在RA誘導(dǎo)ESC分化過程中,敲除C1EIS抑制SSC分化形成,證明C1EIS基因在調(diào)控家禽ESC向SSC分化上發(fā)揮重要作用。
【關(guān)鍵詞】：雞胚胎干細(xì)胞 雞胚精原干細(xì)胞 CRISPR/Cas9 C1EIS
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S831
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 縮略詞表7-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-18
• 1 誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成雄性生殖細(xì)胞方法10-14
• 2 CRISPR/Cas9技術(shù)研究進(jìn)展14-16
• 3 研究目的與意義16-18
• 第二章 雞C1EIS基因cDNA序列的克隆與生物信息學(xué)分析18-27
• 1 材料與方法18-22
• 1.1 材料18-19
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑18
• 1.1.2 主要儀器和設(shè)備18-19
• 1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成19
• 1.2 方法19-22
• 1.2.1 雞睪丸組織總RNA提取19
• 1.2.2 反轉(zhuǎn)錄睪丸組織cDNA19-20
• 1.2.3 C1EIS基因克隆20-21
• 1.2.4 C1EIS基因TA克隆測(cè)序21-22
• 1.2.5 C1EIS基因生物信息學(xué)分析22
• 2 結(jié)果22-26
• 2.1 C1EIS基因克隆22
• 2.2 C1EIS基因生物信息學(xué)分析22-26
• 2.2.1 C1EIS蛋白理化性質(zhì)分析22-23
• 2.2.2 C1EIS蛋白信號(hào)肽與亞細(xì)胞定位分析23
• 2.2.3 C1EIS蛋白糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)分析23-25
• 2.2.4 C1EIS蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)分析25
• 2.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析25-26
• 3 討論26
• 4 小結(jié)26-27
• 第三章 C1EIS基因CRISPR/Cas9載體構(gòu)建與活性驗(yàn)證27-37
• 1 材料與方法27-31
• 1.1 材料27-28
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑27-28
• 1.1.2 主要儀器和設(shè)備28
• 1.1.3 主要試劑配制28
• 1.2 方法28-31
• 1.2.1 C1EIS靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)與合成28
• 1.2.2 寡核苷酸鏈雜交28
• 1.2.3 pcDNA3.0質(zhì)粒酶切28-29
• 1.2.4 sgRNA,C1EIS與載體連接29
• 1.2.5 載體轉(zhuǎn)化29
• 1.2.6 菌液PCR檢測(cè)與過表達(dá)載體酶切鑒定29-30
• 1.2.7 雞DF-1細(xì)胞培養(yǎng)傳代30
• 1.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染30-31
• 1.2.9 流式細(xì)胞分選31
• 1.2.10 T7E1酶切與TA克隆檢測(cè)CRISPR/Cas載體活性31
• 2 結(jié)果31-35
• 2.1 載體結(jié)構(gòu)與靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)31-33
• 2.2 sgRNA鑒定33
• 2.3 pcDNA3.0-C1EIS載體鑒定33-34
• 2.4 雞DF-1細(xì)胞培養(yǎng)34
• 2.5 CRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)染條件探索34-35
• 2.6 CRISPR/Cas系統(tǒng)在DF-1細(xì)胞系上敲除C1EIS基因35
• 3 討論35-36
• 4 小結(jié)36-37
• 第四章 C1EIS基因?qū)﹄u胚胎干細(xì)向雄性生殖細(xì)胞分化的影響37-45
• 1 材料和方法37-40
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料37
• 1.2 主要儀器和設(shè)備37-38
• 1.3 主要試劑38
• 1.4 主要試劑配制38
• 1.5 細(xì)胞處理及分組38
• 1.6 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)38-39
• 1.7 熒光定量PCR檢測(cè)39
• 1.8 流式細(xì)胞檢測(cè)39-40
• 2 結(jié)果40-44
• 2.1 雞ESCs鑒定40-41
• 2.2 ESC形態(tài)學(xué)變化41
• 2.3 細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)41-42
• 2.4 流式細(xì)胞檢測(cè)42-43
• 2.5 Quantitative Real Time PCR(QRT—PCR)檢測(cè)43-44
• 3 討論44
• 4 小結(jié)44-45
• 全文結(jié)論與創(chuàng)新45-46
• 結(jié)論45
• 創(chuàng)新45-46
• 參考文獻(xiàn)46-53
• 致謝53-54
• 碩士期間發(fā)表的論文54-55

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