本文關(guān)鍵詞：禽腦脊髓炎病毒VP1蛋白納米抗體的篩選及活性檢測

  更多相關(guān)文章： AEV 納米抗體 酵母雙雜交 原核表達(dá) 間接ELISA 雞胚中和試驗

【摘要】：禽腦脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)主要侵害幼禽的中樞神經(jīng)系統(tǒng),引起雛雞、火雞、鵪鶉等出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、麻痹和頭頸震顫。產(chǎn)蛋雞感染AEV后無明顯神經(jīng)癥狀,但能引起產(chǎn)蛋量的下降。AEV VP1蛋白高度保守且是主要的宿主保護(hù)性免疫蛋白,含有大多數(shù)特異性中和位點和主要的中和表位。目前AE缺乏有效的診斷和治療方法,只能通過免疫接種進(jìn)行預(yù)防。針對AEV高效、特異、廉價抗體的開發(fā),更有利于AEV的早期檢測和研究。納米抗體對抗原親和力和特異性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低,便于大規(guī)模生產(chǎn),在病原的檢測與研究方面有廣闊的應(yīng)用前景。本研究的目的是以AEV-VP1蛋白作為誘餌蛋白,采用酵母雙雜交技術(shù)對非免疫雙峰駝納米抗體酵母文庫進(jìn)行篩選,期望得到能與AEV反應(yīng)活性高的納米抗體,為該病的診斷和病原學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。主要獲得以下結(jié)果:1.設(shè)計合成1對含有EcoR I、Sal I雙酶切位點的特異性引物,采用PCR方法擴(kuò)增AEV SX株VP1基因,將其克隆到pGBKT7載體上,命名為pBD-VP1,對其進(jìn)行序列測定分析,結(jié)果表明,克隆的VP1基因序列沒有突變。所構(gòu)建的pBD-VP1誘餌質(zhì)粒無毒性和自激活作用,可用于文庫的篩選。2.將30℃過夜培養(yǎng)收集的4 mL誘餌菌[Y2H Gold(pBD-VP1)]與1 mL文庫菌[Y187(pAD-VHH)]混合、進(jìn)行雜交。雜交后將形成的結(jié)合子離心后涂于50個150 mm DDO(-Ade-His-Trp-leu)/X/A平板,30℃培養(yǎng)3 d~5 d,對篩選到的藍(lán)色菌落進(jìn)行標(biāo)記。選擇200個陽性克隆中的40個優(yōu)勢菌落轉(zhuǎn)接QDO/X/A平板進(jìn)行培養(yǎng),獲得了9個陽性克隆。對9個陽性克隆進(jìn)行了酵母回轉(zhuǎn)驗證、序列測定與比對分析,最終獲得了8株抗AEV SX株VP1蛋白的納米抗體。3.構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28as-VHH,將重組質(zhì)粒pET28as-VHH轉(zhuǎn)入BL21(DE3)表達(dá)菌中,對最適表達(dá)溫度、IPTG濃度及誘導(dǎo)時間進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,最適IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol/L、最適誘導(dǎo)表達(dá)溫度為30℃、最適誘導(dǎo)時間為3 h。純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析,8株抗AEV SX株VP1蛋白的重組納米抗體大小約為34 ku,與預(yù)期結(jié)果相符。4.用間接ELISA測定重組VHH的反應(yīng)活性,結(jié)果表明:未經(jīng)稀釋的陽性對照孔OD450平均值為1.056[OD450=1.056(D4501)],陰性對照孔OD450平均值0.048[OD450=0.048(OD450㩳0.1)]。參考IDEXX提供的判定標(biāo)準(zhǔn),陰陽性對照均成立,標(biāo)簽樣品為陰性對照2的OD450㩳0.05,表示反應(yīng)很微弱。陽性對照在5個不同稀釋度下反應(yīng)活性成線性關(guān)系依次降低。VHH4和VHH9的反應(yīng)原性高于陽性對照,且VHH9的高于VHH4;其余6株低于陽性對照。5.雞胚中和試驗測定重組VHH中和效價,結(jié)果表明:陽性血清中和效價為1:717,VHH9和VHH4中和效價分別為1:609和1:512,說明篩選的兩株納米抗體VHH9和VHH4具有較好的中和效價。綜上所述,本研究采用酵母雙雜交技術(shù)對非免疫雙峰駝納米抗體酵母文庫進(jìn)行了篩選。通過共轉(zhuǎn)驗證、序列比對分析,成功獲得了8株抗AEV SX分離株VP1蛋白的重組納米抗體。將獲得的8株納米抗體表達(dá)、純化后通過間接ELISA和雞胚中和試驗對其進(jìn)行活性了檢測,最終獲得了2株活性較好的納米抗體,為AEV抗原檢測和病原學(xué)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：AEV 納米抗體 酵母雙雜交 原核表達(dá) 間接ELISA 雞胚中和試驗
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 文獻(xiàn)綜述12-23
• 第一章 禽腦脊髓炎研究進(jìn)展12-18
• 1.1 AEV病原學(xué)特征12-15
• 1.1.1 AEV的歷史背景與分類12
• 1.1.2 病毒的形態(tài)特征及理化性質(zhì)12-13
• 1.1.3 病毒的增殖培養(yǎng)13
• 1.1.4 AEV基因組13-14
• 1.1.5VP1蛋白及功能14
• 1.1.6 AEV VP1蛋白抗原表位分析14-15
• 1.2 AE的流行病學(xué)15-16
• 1.3 AEV致病機(jī)理16
• 1.4 AE臨床癥狀和病理變化16
• 1.5 AEV檢測16-17
• 1.6 AE的防制17-18
• 第二章 納米抗體研究進(jìn)展18-23
• 2.1 納米抗體的結(jié)構(gòu)18-19
• 2.2 納米抗體的性質(zhì)19-20
• 2.2.1 親和力高19
• 2.2.2 高穩(wěn)定性和水溶性19-20
• 2.2.3 識別獨特的抗原表位20
• 2.2.4 容易表達(dá)和規(guī)�；a(chǎn)20
• 2.2.5 易多聚化成多價抗體20
• 2.3 納米抗體的應(yīng)用20-23
• 2.3.1 在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的應(yīng)用20-21
• 2.3.2 作為診斷工具的使用21-23
• 實驗研究23-48
• 第三章 禽腦脊髓炎病毒VP1蛋白納米抗體的篩選23-35
• 3.1 材料23-25
• 3.1.1 菌株、質(zhì)粒、文庫23
• 3.1.2 引物23-24
• 3.1.3 酶和試劑24
• 3.1.4 主要培養(yǎng)基及常用試劑的配制24-25
• 3.1.5 主要儀器25
• 3.2 方法25-28
• 3.2.1 pBD-VP1誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建25-27
• 3.2.2 誘餌質(zhì)粒pBD-VP1毒性和自激活檢測27
• 3.2.3 文庫篩選與鑒定27-28
• 3.3 結(jié)果28-33
• 3.3.1 AEV VP1基因擴(kuò)增28-29
• 3.3.2 誘餌質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定29
• 3.3.3 誘餌質(zhì)粒pBD-VP1測序29-30
• 3.3.4 誘餌質(zhì)粒pBD-VP1自激活檢測30
• 3.3.5 文庫篩選30-31
• 3.3.6 藍(lán)色菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定31
• 3.3.7 共轉(zhuǎn)驗證31-32
• 3.3.8 陽性文庫質(zhì)粒測序32-33
• 3.4 討論33-34
• 3.5 小結(jié)34-35
• 第四章 禽腦脊髓炎病毒VP1蛋白納米抗體的表達(dá)純化與活性檢測35-48
• 4.1 材料35-36
• 4.1.1 質(zhì)粒、載體和菌株35
• 4.1.2 主要試劑35
• 4.1.3 常用緩沖液配制35-36
• 4.1.4 主要儀器設(shè)備36
• 4.2 方法36-41
• 4.2.1 pET28as-VHH表達(dá)載體的構(gòu)建36-39
• 4.2.2 誘導(dǎo)表達(dá)納米抗體39-40
• 4.2.3 納米抗體的制備純化40
• 4.2.4 間接ELISA檢測VHH的活性40-41
• 4.2.5 雞胚中和試驗檢測VHH的活性41
• 4.3 結(jié)果41-47
• 4.3.1 pET28as-VHH表達(dá)載體的PCR鑒定41
• 4.3.2 pET28as-VHH表達(dá)載體的酶切鑒定41-42
• 4.3.3 pET28as-VHH表達(dá)載體測序42-43
• 4.3.4 pET28as-VHH重組蛋白存在形式的檢測43
• 4.3.5 IPTG最佳誘導(dǎo)溫度的確定43-44
• 4.3.6 IPTG最佳誘導(dǎo)濃度的確定44
• 4.3.7 最佳誘導(dǎo)時間的確定44-45
• 4.3.8 重組VHH的表達(dá)與純化45-46
• 4.3.9 a重組VHH與AEV的反應(yīng)活性46
• 4.3.410 b雞胚中和試驗測定VHH活性46-47
• 4.4 討論47
• 4.5 小結(jié)47-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 附錄56-60
• 致謝60-61
• 作者簡介61

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本文編號：1098289