本文關(guān)鍵詞：植物精油對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

  更多相關(guān)文章： 植物精油 脂多糖 奶牛乳腺上皮細(xì)胞 原代培養(yǎng) 炎性損傷

【摘要】：奶牛乳房炎是影響我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。近年來,關(guān)于奶牛乳房炎在細(xì)胞水平的研究逐漸受到人們的重視,奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,b MEC)是奶牛乳腺免疫的重要組成部分,也是研究奶牛乳房炎發(fā)病機(jī)理和篩選有效治療藥物的重要材料。植物精油是從植物中萃取而來的芳香物質(zhì),其分子量小,滲透性強(qiáng),可被機(jī)體迅速吸收,研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)奶牛乳房炎多種致病菌有良好的抑菌、殺菌效果。本研究通過b MEC的原代培養(yǎng),獲得純化的b MEC;通過脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo),建立b MEC炎癥模型;通過上皮細(xì)胞活力和形態(tài)學(xué)比較,分析植物精油對(duì)LPS誘導(dǎo)b MEC炎性損傷的影響,以及NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的表達(dá),旨在探究植物精油對(duì)LPS誘導(dǎo)的b MEC炎性損傷的保護(hù)作用,為有效治療奶牛乳房炎藥物的篩選提供理論依據(jù)。1.奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)利用組織塊法和酶消化法從無泌乳史奶牛乳腺組織中成功分離到了b MEC,具有b MEC的典型形態(tài)學(xué)特征,可表達(dá)上皮細(xì)胞特異性骨架蛋白-角蛋白18(CK-18)。在第2~8 d時(shí)生長(zhǎng)曲線呈S型,表明細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好;10代以內(nèi)的b MEC極化細(xì)胞少,傳至20代后極化細(xì)胞顯著增多。2.乳腺組織的凍存-80℃下在凍存液A(FBS:DMSO:DMEM/F12=7:2:1)和凍存液B(FBS:DMEM/F12:DMSO:HEPES/丙酮酸鈉貯存液=10:7:2:1)中,分別快速凍存奶牛乳腺組織塊(4~5 mm3),隨后轉(zhuǎn)移至液氮中保存。8個(gè)月后復(fù)蘇乳腺組織,結(jié)果顯示凍存液A中組織塊成活率為50%,凍存液B中組織塊成活率為56%。3.b MEC炎癥模型的建立用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將LPS配制成0μg/m L、10μg/m L、50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L 5種不同濃度,分別作用于b MEC 12 h,細(xì)胞活力檢測(cè)OD值分別為0.62±0.05、0.61±0.09、0.46±0.06、0.31±0.07、0.02±0.01,表明隨著LPS濃度的增大,細(xì)胞活力呈下降趨勢(shì)。再分別用0μg/m L、10μg/m L、25μg/m L、50μg/m L、100μg/m L5種濃度的LPS分別作用于b MEC 12 h,細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和β-防御素、IL-1β、IL-8、TNFα基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明,50μg/m L的LPS對(duì)細(xì)胞形態(tài)損傷較小,能顯著上調(diào)炎性細(xì)胞因子表達(dá)量。本試驗(yàn)選用50μg/m L的LPS處理細(xì)胞12 h,建立炎癥模型。4.四種植物精油對(duì)b MEC炎性損傷的影響分別用不同體積分?jǐn)?shù)的香精油、茶樹油、香樟油和桉樹油處理b MEC 12 h,細(xì)胞活力測(cè)定與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示,百里香精油、茶樹油、香樟油和桉樹油安全作用劑量(體積分?jǐn)?shù))分別為0.02%、0.04%、0.04%、0.03%。熒光定量PCR分析結(jié)果表明,0.01%的百里香精油、0.04%的茶樹油、0.03%的香樟油和0.02%的桉樹油能顯著下調(diào)β-防御素、IL-1β、IL-8、TNFα以及NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子TRAF6、Bp65、Bp50的表達(dá)。綜上所述,無泌乳史的育成奶牛乳腺組織-198℃凍存8個(gè)月,可用于分離培養(yǎng)bMEC;50μg/m L的LPS處理純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞12 h,可用于建立b MEC炎癥模型;一定濃度的百里香精油、茶樹油、香樟油和桉樹油有降低LPS損傷乳腺細(xì)胞的作用。
【關(guān)鍵詞】：植物精油 脂多糖 奶牛乳腺上皮細(xì)胞 原代培養(yǎng) 炎性損傷
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 英文縮略表14-15
• 第一章 引言15-22
• 1.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)研究進(jìn)展15-18
• 1.1.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)發(fā)展歷程15
• 1.1.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)15-16
• 1.1.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞純化方法16-17
• 1.1.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的鑒定技術(shù)17-18
• 1.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞應(yīng)用研究18-19
• 1.2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞用于奶牛乳房炎的研究18-19
• 1.2.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞用于泌乳調(diào)控的研究19
• 1.2.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞用于藥物篩選的研究19
• 1.3 植物精油研究概況19-21
• 1.3.1 百里香精油研究概況20
• 1.3.2 茶樹油研究概況20-21
• 1.3.3 香樟油研究概況21
• 1.3.4 桉樹油研究概況21
• 1.4 本研究的目的與意義21-22
• 第二章 奶牛乳腺上皮細(xì)胞分離與培養(yǎng)22-33
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物22
• 2.1.2 主要試劑22
• 2.1.3 溶液配制22
• 2.1.4 主要儀器22-23
• 2.2 試驗(yàn)方法23-25
• 2.2.1 乳腺組織取樣23
• 2.2.2 乳腺上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)及純化23-24
• 2.2.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞鑒定24-25
• 2.2.4 奶牛乳腺上皮掃描電鏡下形態(tài)學(xué)觀察25
• 2.2.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞傳代25
• 2.2.6 生長(zhǎng)曲線的繪制25
• 2.2.7 乳腺組織切片觀察25
• 2.3 試驗(yàn)結(jié)果25-30
• 2.3.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)25-26
• 2.3.2 不同部位乳腺組織分離培養(yǎng)細(xì)胞結(jié)果對(duì)比26-27
• 2.3.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞純化27-28
• 2.3.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征28
• 2.3.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的鑒定28-29
• 2.3.6 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的穩(wěn)定性29
• 2.3.7 生長(zhǎng)曲線的繪制29-30
• 2.3.8 乳腺組織切片觀察30
• 2.4 討論30-31
• 2.5 結(jié)論31-33
• 第三章 奶牛乳腺組織的凍存33-37
• 3.1 材料33
• 3.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物33
• 3.1.2 主要試劑33
• 3.1.3 主要溶液配制33
• 3.1.4 主要儀器33
• 3.2 試驗(yàn)方法33-34
• 3.2.1 乳腺組織取樣33
• 3.2.2 奶牛乳腺組織凍存33-34
• 3.2.3 乳腺組織復(fù)蘇及細(xì)胞培養(yǎng)34
• 3.2.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的鑒定34
• 3.2.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察34
• 3.3 結(jié)果34-36
• 3.3.1 凍存奶牛乳腺組織活性34
• 3.3.2 細(xì)胞形態(tài)觀察34-36
• 3.4 討論36
• 3.5 結(jié)論36-37
• 第四章 奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型的建立37-46
• 4.1 材料37
• 4.1.1 細(xì)胞37
• 4.1.2 主要試劑37
• 4.1.3 試劑配制37
• 4.1.4 主要儀器37
• 4.2 試驗(yàn)方法37-40
• 4.2.1 LPS細(xì)胞毒性檢測(cè)37-38
• 4.2.2 形態(tài)學(xué)觀察38
• 4.2.3 炎癥因子表達(dá)量的檢測(cè)38-40
• 4.3 結(jié)果40-44
• 4.3.1 LPS細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果40
• 4.3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察40-42
• 4.3.3 炎癥因子表達(dá)量測(cè)定結(jié)果42-44
• 4.4 討論44-45
• 4.5 結(jié)論45-46
• 第五章 四種植物精油對(duì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究46-55
• 5.1 材料與方法46-47
• 5.1.1 細(xì)胞來源46
• 5.1.2 主要試劑46
• 5.1.3 試劑配制46
• 5.1.4 主要儀器46-47
• 5.2 試驗(yàn)方法47-48
• 5.2.1 植物精油細(xì)胞毒性試驗(yàn)47
• 5.2.2 精油抗炎試驗(yàn)47
• 5.2.3 炎癥因子表達(dá)量的檢測(cè)47
• 5.2.4 NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵因子表達(dá)量的測(cè)定47-48
• 5.3 結(jié)果48-53
• 5.3.1 增溶劑的細(xì)胞毒性作用比較48
• 5.3.2 植物精油的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果48-51
• 5.3.3 植物精油對(duì)炎癥反應(yīng)抑制效果51-53
• 5.3.4 植物精油對(duì)NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵因子表達(dá)量的影響53
• 5.4 討論53-54
• 5.5 結(jié)論54-55
• 第六章 全文結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-63
• 致謝63-64
• 作者簡(jiǎn)歷64

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 林杰;王旭榮;楊志強(qiáng);王磊;張景艷;孔曉軍;王學(xué)智;秦哲;王孝武;李建喜;;青海省某奶牛場(chǎng)頑固性乳房炎主要病原菌的分離鑒定與耐藥性研究[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2015年12期

2 秦海燕;葉平;索志榮;;香樟精油自然揮發(fā)對(duì)肺炎小白鼠的保護(hù)作用[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2015年11期

3 泰東梅;劉紅云;茅慧玲;汪海峰;王，

本文編號(hào)：1097557