本文關鍵詞：HSP70對熱應激條件下仔豬睪丸支持細胞乳酸合成的影響

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【摘要】：睪丸支持細胞(Sertoli cells,SCs)產生的乳酸,不僅作為精細胞發(fā)育的營養(yǎng)物質,而且在精子生成過程中起到抗凋亡作用。我們已經知道熱應激對許多哺乳動物的精子生成都有負面影響,而熱休克蛋白(heat shock protein,HSPs)在熱應激反應中起到抗凋亡作用。但是HSPs是否通過熱誘導生成的乳酸對精子生成起到間接抗凋亡作用還不清楚。本研究的目的是:(1)熱應激是否引起乳酸合成量的變化;(2)參與熱應激后乳酸合成的主要酶類及其表達量的變化;(3)熱應激后主要表達的HSPs種類及其表達量的變化;(4)HSPs是否通過影響乳酸合成相關酶的表達調控熱應激后乳酸的合成。本研究以20日齡左右的仔豬睪丸為實驗材料,首先用43°C培養(yǎng)箱對體外培養(yǎng)的支持細胞進行30 min的熱處理,隨后放回32°C培養(yǎng)箱進行(0 h,12 h,24 h,36 h,48 h)熱應激后恢復處理,收集培養(yǎng)基和細胞進行乳酸合成量的測定。接著用同樣的方法處理,用PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測出支持細胞乳酸合成相關的主要酶類(GLUTs/LDHs)和熱應激后主要起作用的HSPs,并進一步對篩選出的GLUTs/LDHs/HSPs用熒光定量RCR和western blot測定熱應激后的表達變化。然后用HSPs抑制劑和RNA干擾試劑分別處理熱應激前的支持細胞,并用western blot檢測HSPs的蛋白水平以篩選抑制劑,隨后用篩選出的適宜濃度的抑制劑和干擾試劑再分別處理支持細胞,并檢測支持細胞熱應激后乳酸合成量,同時用western blot和熒光定量PCR檢測乳酸合成相關酶的表達水平的變化。實驗結果如下:(1)體外培養(yǎng)的仔豬睪丸支持細胞受到熱應激(43°C培養(yǎng)30 min)后,乳酸產量增加,并且隨著熱應激后恢復時間的延長而增加,在24 h時達到最大值(P0.01)。(2)GLUT3,LDHA為仔豬睪丸支持細胞乳酸生成過程的兩種主要的酶,HSP70為仔豬睪丸支持細胞熱應答主要的HSPs。(3)熱應激(43°C培養(yǎng)30 min)促進了GLUT3、LDHA的表達,mRNA水平在12 h時達最大值(P0.01),蛋白水平在24 h時達最大值(P0.01)。(4)熱應激(43°C培養(yǎng)30 min)促進了HSP70的表達,mRNA水平在0 h達最大值(P0.01),蛋白水平在24 h時達最大值(P0.01)。(5)HSP70抑制劑(槲皮素)和HSP70的siRNA都顯著抑制熱應激后乳酸合成量以及GLUT3和LDHA的表達。綜上所述,熱應激誘導產生的HSP70通過上調SLC2A3(GLUT3)和LDHA的表達,促進了熱應激后乳酸的合成。這為熱應激提高生精細胞抗凋亡的調節(jié)機制提供了新的思路。
【關鍵詞】：HSP70 乳酸 睪丸支持細胞 豬 熱應激
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S828
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 第一章 文獻綜述11-23
• 1 睪丸支持細胞的功能11-13
• 1.1 支持細胞的結構和位置11-12
• 1.2 支持細胞參與形成血睪屏障12
• 1.3 支持細胞對生精細胞的支持營養(yǎng)作用12-13
• 2 睪丸內乳酸的作用13-14
• 2.1 睪丸內乳酸的產生13
• 2.2 乳酸的作用13-14
• 3 睪丸熱應激的研究概況14-17
• 3.1 熱應激概述14-15
• 3.2 熱應激對睪丸各類細胞的影響15-17
• 4 HSPs與睪丸熱應激17-22
• 4.1 HSPs在熱應激中的主要功能17-18
• 4.2 HSPs在熱應激中的表達調控機制18-19
• 4.3 幾種HSPs在睪丸熱應激時的作用19-22
• 5 研究展望22-23
• 第二章 引言23-25
• 第三章 實驗材料與方法25-36
• 1 實驗材料25-28
• 1.1 實驗材料25
• 1.2 實驗相關試劑25-26
• 1.3 試劑配制26-27
• 1.4 主要實驗儀器27-28
• 2 實驗方法28-35
• 2.1 支持細胞分離培養(yǎng)28-29
• 2.2 RNA干擾29
• 2.3 熱處理29
• 2.4 槲皮素處理29-30
• 2.5 蛋白檢測30-32
• 2.6 mRNA檢測32-35
• 2.7 乳酸檢測35
• 3 統(tǒng)計分析35-36
• 第四章 實驗結果36-48
• 1 RNA完整性檢測36
• 2 熒光定量擴增曲線和融解曲線分析36-37
• 3 熱應激對仔豬睪丸支持細胞乳酸合成的影響37-40
• 3.1 熱應激對仔豬睪丸支持細胞乳酸合成量的影響37-38
• 3.2 GLUT3和LDHA為熱應激前后支持細胞主要的乳酸合成相關酶38-39
• 3.3 熱應激對仔豬睪丸支持細胞SLC2A3和LDHA mRNA表達的影響39
• 3.4 熱應激對仔豬睪丸支持細胞GLUT3和LDHA蛋白表達的影響39-40
• 4 熱應激對仔豬睪丸支持細胞熱休克蛋白的影響40-41
• 4.1 仔豬睪丸支持細胞在熱應激后起主要作用的HSPs種類40
• 4.2 熱應激處理對HSP70.2 mRNA表達的影響40-41
• 4.3 熱應激處理對HSP70蛋白表達的影響41
• 5 槲皮素對乳酸合成的影響41-45
• 5.1 槲皮素對HSP70蛋白表達的影響41-42
• 5.2 槲皮素對乳酸合成量的影響42-43
• 5.3 槲皮素對GLUT3和LDHA蛋白表達的影響43
• 5.4 槲皮素對SLC2A3和LDHA mRNA表達的影響43-44
• 5.5 槲皮素對SLC2A3和LDHA mRNA表達的影響44-45
• 6 siRNA對睪丸支持細胞乳酸合成的影響45-48
• 6.1 si RNA對HSP70蛋白表達的影響45-46
• 6.2 si RNA對乳酸合成量的影響46
• 6.3 si RNA對GLUT3和LDHA蛋白的影響46-47
• 6.4 si RNA對支持細胞SLC3A2/LDHA mRNA的影響47-48
• 第五章 討論48-51
• 1 熱應激對睪丸支持細胞乳酸生成的影響48
• 2 乳酸合成量的增加與GLUT3和LDHA有關48-49
• 3 HSP70為仔豬睪丸支持細胞主要的熱誘導HSPs49
• 4 HSP70參與熱應激后乳酸合成的調節(jié)49-50
• 5 總結50-51
• 第六章 結論51-52
• 參考文獻52-61
• 致謝61

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