本文關(guān)鍵詞：HSP70對(duì)熱應(yīng)激條件下仔豬睪丸支持細(xì)胞乳酸合成的影響

  更多相關(guān)文章： HSP70 乳酸 睪丸支持細(xì)胞 豬 熱應(yīng)激

【摘要】：睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cells,SCs)產(chǎn)生的乳酸,不僅作為精細(xì)胞發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),而且在精子生成過(guò)程中起到抗凋亡作用。我們已經(jīng)知道熱應(yīng)激對(duì)許多哺乳動(dòng)物的精子生成都有負(fù)面影響,而熱休克蛋白(heat shock protein,HSPs)在熱應(yīng)激反應(yīng)中起到抗凋亡作用。但是HSPs是否通過(guò)熱誘導(dǎo)生成的乳酸對(duì)精子生成起到間接抗凋亡作用還不清楚。本研究的目的是:(1)熱應(yīng)激是否引起乳酸合成量的變化;(2)參與熱應(yīng)激后乳酸合成的主要酶類(lèi)及其表達(dá)量的變化;(3)熱應(yīng)激后主要表達(dá)的HSPs種類(lèi)及其表達(dá)量的變化;(4)HSPs是否通過(guò)影響乳酸合成相關(guān)酶的表達(dá)調(diào)控?zé)釕?yīng)激后乳酸的合成。本研究以20日齡左右的仔豬睪丸為實(shí)驗(yàn)材料,首先用43°C培養(yǎng)箱對(duì)體外培養(yǎng)的支持細(xì)胞進(jìn)行30 min的熱處理,隨后放回32°C培養(yǎng)箱進(jìn)行(0 h,12 h,24 h,36 h,48 h)熱應(yīng)激后恢復(fù)處理,收集培養(yǎng)基和細(xì)胞進(jìn)行乳酸合成量的測(cè)定。接著用同樣的方法處理,用PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出支持細(xì)胞乳酸合成相關(guān)的主要酶類(lèi)(GLUTs/LDHs)和熱應(yīng)激后主要起作用的HSPs,并進(jìn)一步對(duì)篩選出的GLUTs/LDHs/HSPs用熒光定量RCR和western blot測(cè)定熱應(yīng)激后的表達(dá)變化。然后用HSPs抑制劑和RNA干擾試劑分別處理熱應(yīng)激前的支持細(xì)胞,并用western blot檢測(cè)HSPs的蛋白水平以篩選抑制劑,隨后用篩選出的適宜濃度的抑制劑和干擾試劑再分別處理支持細(xì)胞,并檢測(cè)支持細(xì)胞熱應(yīng)激后乳酸合成量,同時(shí)用western blot和熒光定量PCR檢測(cè)乳酸合成相關(guān)酶的表達(dá)水平的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:(1)體外培養(yǎng)的仔豬睪丸支持細(xì)胞受到熱應(yīng)激(43°C培養(yǎng)30 min)后,乳酸產(chǎn)量增加,并且隨著熱應(yīng)激后恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,在24 h時(shí)達(dá)到最大值(P0.01)。(2)GLUT3,LDHA為仔豬睪丸支持細(xì)胞乳酸生成過(guò)程的兩種主要的酶,HSP70為仔豬睪丸支持細(xì)胞熱應(yīng)答主要的HSPs。(3)熱應(yīng)激(43°C培養(yǎng)30 min)促進(jìn)了GLUT3、LDHA的表達(dá),mRNA水平在12 h時(shí)達(dá)最大值(P0.01),蛋白水平在24 h時(shí)達(dá)最大值(P0.01)。(4)熱應(yīng)激(43°C培養(yǎng)30 min)促進(jìn)了HSP70的表達(dá),mRNA水平在0 h達(dá)最大值(P0.01),蛋白水平在24 h時(shí)達(dá)最大值(P0.01)。(5)HSP70抑制劑(槲皮素)和HSP70的siRNA都顯著抑制熱應(yīng)激后乳酸合成量以及GLUT3和LDHA的表達(dá)。綜上所述,熱應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70通過(guò)上調(diào)SLC2A3(GLUT3)和LDHA的表達(dá),促進(jìn)了熱應(yīng)激后乳酸的合成。這為熱應(yīng)激提高生精細(xì)胞抗凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：HSP70 乳酸 睪丸支持細(xì)胞 豬 熱應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S828
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-23
• 1 睪丸支持細(xì)胞的功能11-13
• 1.1 支持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和位置11-12
• 1.2 支持細(xì)胞參與形成血睪屏障12
• 1.3 支持細(xì)胞對(duì)生精細(xì)胞的支持營(yíng)養(yǎng)作用12-13
• 2 睪丸內(nèi)乳酸的作用13-14
• 2.1 睪丸內(nèi)乳酸的產(chǎn)生13
• 2.2 乳酸的作用13-14
• 3 睪丸熱應(yīng)激的研究概況14-17
• 3.1 熱應(yīng)激概述14-15
• 3.2 熱應(yīng)激對(duì)睪丸各類(lèi)細(xì)胞的影響15-17
• 4 HSPs與睪丸熱應(yīng)激17-22
• 4.1 HSPs在熱應(yīng)激中的主要功能17-18
• 4.2 HSPs在熱應(yīng)激中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制18-19
• 4.3 幾種HSPs在睪丸熱應(yīng)激時(shí)的作用19-22
• 5 研究展望22-23
• 第二章 引言23-25
• 第三章 實(shí)驗(yàn)材料與方法25-36
• 1 實(shí)驗(yàn)材料25-28
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料25
• 1.2 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑25-26
• 1.3 試劑配制26-27
• 1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器27-28
• 2 實(shí)驗(yàn)方法28-35
• 2.1 支持細(xì)胞分離培養(yǎng)28-29
• 2.2 RNA干擾29
• 2.3 熱處理29
• 2.4 槲皮素處理29-30
• 2.5 蛋白檢測(cè)30-32
• 2.6 mRNA檢測(cè)32-35
• 2.7 乳酸檢測(cè)35
• 3 統(tǒng)計(jì)分析35-36
• 第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-48
• 1 RNA完整性檢測(cè)36
• 2 熒光定量擴(kuò)增曲線(xiàn)和融解曲線(xiàn)分析36-37
• 3 熱應(yīng)激對(duì)仔豬睪丸支持細(xì)胞乳酸合成的影響37-40
• 3.1 熱應(yīng)激對(duì)仔豬睪丸支持細(xì)胞乳酸合成量的影響37-38
• 3.2 GLUT3和LDHA為熱應(yīng)激前后支持細(xì)胞主要的乳酸合成相關(guān)酶38-39
• 3.3 熱應(yīng)激對(duì)仔豬睪丸支持細(xì)胞SLC2A3和LDHA mRNA表達(dá)的影響39
• 3.4 熱應(yīng)激對(duì)仔豬睪丸支持細(xì)胞GLUT3和LDHA蛋白表達(dá)的影響39-40
• 4 熱應(yīng)激對(duì)仔豬睪丸支持細(xì)胞熱休克蛋白的影響40-41
• 4.1 仔豬睪丸支持細(xì)胞在熱應(yīng)激后起主要作用的HSPs種類(lèi)40
• 4.2 熱應(yīng)激處理對(duì)HSP70.2 mRNA表達(dá)的影響40-41
• 4.3 熱應(yīng)激處理對(duì)HSP70蛋白表達(dá)的影響41
• 5 槲皮素對(duì)乳酸合成的影響41-45
• 5.1 槲皮素對(duì)HSP70蛋白表達(dá)的影響41-42
• 5.2 槲皮素對(duì)乳酸合成量的影響42-43
• 5.3 槲皮素對(duì)GLUT3和LDHA蛋白表達(dá)的影響43
• 5.4 槲皮素對(duì)SLC2A3和LDHA mRNA表達(dá)的影響43-44
• 5.5 槲皮素對(duì)SLC2A3和LDHA mRNA表達(dá)的影響44-45
• 6 siRNA對(duì)睪丸支持細(xì)胞乳酸合成的影響45-48
• 6.1 si RNA對(duì)HSP70蛋白表達(dá)的影響45-46
• 6.2 si RNA對(duì)乳酸合成量的影響46
• 6.3 si RNA對(duì)GLUT3和LDHA蛋白的影響46-47
• 6.4 si RNA對(duì)支持細(xì)胞SLC3A2/LDHA mRNA的影響47-48
• 第五章 討論48-51
• 1 熱應(yīng)激對(duì)睪丸支持細(xì)胞乳酸生成的影響48
• 2 乳酸合成量的增加與GLUT3和LDHA有關(guān)48-49
• 3 HSP70為仔豬睪丸支持細(xì)胞主要的熱誘導(dǎo)HSPs49
• 4 HSP70參與熱應(yīng)激后乳酸合成的調(diào)節(jié)49-50
• 5 總結(jié)50-51
• 第六章 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-61
• 致謝61

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