本文關(guān)鍵詞：泰山松花粉多糖對重組PRRSV GP5蛋白免疫增強作用的研究

  更多相關(guān)文章： 泰山松花粉多糖 免疫增強作用 豬繁殖與呼吸綜合征病毒 囊膜糖蛋白5 亞單位疫苗

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是一種高度接觸性的病毒性疾病,發(fā)病率高,死亡率也高,最易感動物是妊娠母豬和1月齡內(nèi)的仔豬,主要引起豬的呼吸困難和繁殖障礙性疾病,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失�，F(xiàn)階段使用的PRRSV商品化疫苗主要是減毒活疫苗和滅活苗。常用的PRRSV減毒活疫苗存在加速PRRSV毒株變異的風(fēng)險,而滅活疫苗僅能誘導(dǎo)極其有限的保護性免疫反應(yīng)。PRRSV亞單位疫苗是PRRS免疫預(yù)防的一個重要研發(fā)方向,但是亞單位疫苗通常免疫原性較低,因此,篩選針對PRRSV亞單位疫苗的高效免疫佐劑是提高現(xiàn)有亞單位疫苗免疫效力的重要途徑。本研究以原核表達的高致病性PRRSV囊膜糖蛋白5(GP5)為免疫原,不同劑量的泰山松花粉多糖(Taishan Pinus massoniana pollen polysaccharides,TPPPS)作為免疫佐劑,以評定TPPPS對GP5蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫增強作用。本研究主要包含以下兩個部分:1、PRRSV GP5重組質(zhì)粒鑒定與蛋白表達:將重組質(zhì)粒p ET-32a-GP5用PCR、雙酶切進行鑒定并測序,驗證正確的重組質(zhì)粒p ET-32a-GP5轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)p Lys S感受態(tài)細胞中,進行原核蛋白的表達。將表達的蛋白SDS-PAGE分析得到大小約為32 KD的目的條帶。同時,Western-Blot鑒定,結(jié)果可清晰看見約32 KD大小的特異性印跡,與SDS-PAGE分析的結(jié)果相一致。然后,將獲得的蛋白通過His標(biāo)簽鎳層析柱進行純化。2、泰山松花粉多糖對重組PRRSV GP5蛋白的免疫增強作用:本研究選取72只SPF昆明小鼠,隨機分為6組(Ⅰ-Ⅵ)。Ⅰ組注射純化的GP5蛋白,Ⅱ-Ⅳ組分別注射不同濃度的TPPPS(20、40、60 mg/m L)佐劑+GP5蛋白,Ⅴ組注射弗氏佐劑+GP5蛋白,Ⅵ組注射PBS;1周后加強免疫1次。每周隨機挑選3只小鼠采其外周血,用ELISA檢測其抗GP5抗體效價,流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞亞群的比例,用MTT比色法檢測T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率,以ELISA試劑盒分別檢測IFN-γ、IL-2及IL-4細胞因子濃度。結(jié)果表明,所有疫苗免疫組小鼠的以上免疫指標(biāo)均有顯著提高,而添加TPPPS和弗氏佐組的各項指標(biāo)均顯著高于單獨GP5蛋白接種組。3個濃度的TPPPS佐劑中,60mg/m L TPPPS的免疫增強效果最好。本研究表明,PRRSV GP5蛋白誘導(dǎo)了特異性免疫應(yīng)答反應(yīng),TPPPS佐劑對GP5蛋白具有理想的免疫增強作用。這為PRRSV GP5蛋白亞單位疫苗的研制提供了理論依據(jù)和技術(shù)依托。
【關(guān)鍵詞】：泰山松花粉多糖 免疫增強作用 豬繁殖與呼吸綜合征病毒 囊膜糖蛋白5 亞單位疫苗
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S859.79
【目錄】：

• 符號說明5-10
• 中文摘要10-12
• Abstract12-14
• 1.前言14-22
• 1.1 豬繁殖與呼吸綜合征14-17
• 1.1.1 PRRSV生物學(xué)特性14-15
• 1.1.2 PRRSV分子生物學(xué)研究15
• 1.1.2.1 PRRSV基因結(jié)構(gòu)15
• 1.1.2.2 PRRSV編碼的蛋白15
• 1.1.3 PRRS流行現(xiàn)狀15-16
• 1.1.4 PRRS致病機理16
• 1.1.5 臨床癥狀及病理變化16-17
• 1.1.6 診斷和防制17
• 1.2 疫苗的發(fā)展現(xiàn)狀17-18
• 1.2.1 傳統(tǒng)疫苗17-18
• 1.2.1.1 PRRSV滅活苗18
• 1.2.1.2 PRRSV減毒活疫苗18
• 1.3 疫苗佐劑的研究現(xiàn)狀18-21
• 1.3.1 不溶性鋁鹽類佐劑19
• 1.3.2 油乳佐劑19-20
• 1.3.3 表面活性劑類佐劑20
• 1.3.4 細菌微生物類佐劑20
• 1.3.5 中藥類佐劑20-21
• 1.3.6 多糖佐劑21
• 1.4 松花粉多糖的研究進展21
• 1.5 本研究的目的與意義21-22
• 2. 材料與方法22-36
• 2.1 重組質(zhì)粒pET-32a-GP5的鑒定與蛋白的表達22-29
• 2.1.1 試劑與儀器22-23
• 2.1.2 試劑和培養(yǎng)基的配制23-24
• 2.1.3 重組質(zhì)粒pET-32a-GP5的鑒定24-27
• 2.1.3.1 重組質(zhì)粒pET-32a-GP5的轉(zhuǎn)化24-25
• 2.1.3.2 PCR的鑒定25-26
• 2.1.3.3 雙酶切的鑒定26-27
• 2.1.4 重組PRRSV GP5蛋白的表達與純化27-29
• 2.1.4.1 重組PRRSV GP5蛋白的誘導(dǎo)表達27-28
• 2.1.4.2 蛋白的制備與純化28-29
• 2.2 泰山松花粉多糖對PRRSV GP5蛋白的免疫增強作用29-36
• 2.2.1 主要試劑與儀器29
• 2.2.2 主要試劑的配制29-30
• 2.2.3 亞單位疫苗及免疫佐劑制備30
• 2.2.4 動物試驗及免疫程序30
• 2.2.5 松花粉多糖對小鼠體液免疫測定30-34
• 2.2.5.1 血清抗體效價的檢測30-31
• 2.2.5.2 PRRSV特異性中和抗體檢測31-33
• 2.2.5.3 血清中IL-4 的含量檢測33-34
• 2.2.6 松花粉多糖對小鼠細胞免疫的影響34-35
• 2.2.6.1 血清中IFN-γ和IL-2 的含量檢測34
• 2.2.6.2 外周血CD4+、CD8+ T淋巴細胞數(shù)量的測定34-35
• 2.2.6.3 外周血T淋巴細胞增殖35
• 2.2.7 數(shù)據(jù)分析35-36
• 3. 結(jié)果36-44
• 3.1 重組質(zhì)粒pET-32a-GP5的鑒定與蛋白表達36-38
• 3.1.1 重組質(zhì)粒pET-32a-GP5的鑒定36-37
• 3.1.2 重組PRRSV GP5蛋白的表達37-38
• 3.2 松花粉多糖對小鼠體液免疫的影響38-40
• 3.2.1 血清抗體效價38-39
• 3.2.2 免疫血清對PRRSV的中和作用39
• 3.2.3 血清中IL-4 含量的變化39-40
• 3.3 松花粉多糖對小鼠細胞免疫的影響40-44
• 3.3.1 血清中IFN-γ含量的變化40-41
• 3.3.2 血清中IL-2 含量的變化41
• 3.3.3 外周血CD4+ T淋巴細胞百分含量41-42
• 3.3.4 外周血CD8+ T淋巴細胞百分含量42-43
• 3.3.5 外周T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率43-44
• 4. 討論44-46
• 5. 結(jié)論46-47
• 參考文獻47-52
• 致謝52-53
• 個人簡介53-54
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況54

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