本文關(guān)鍵詞：兔出血癥病毒樣顆粒疫苗的研制和雙抗夾心ELISA方法的建立

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【摘要】：兔出血癥病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease virus,RHDV)的感染主要引起成年兔發(fā)生病毒性出血癥(Rabbit Hemorrhagic Disease,RHD),其致死率約70-100%。RHDV感染呈世界性分布,是影響和危害養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展的最主要病原。疫苗接種在治療和預(yù)防RHD疾病傳播中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。盡管近年來亞單位疫苗的研制取得了快速的發(fā)展,但由于抗原制備成本高以及表達(dá)量低等特點,目前商業(yè)疫苗仍然主要是組織滅活疫苗。本研究根據(jù)RHDV結(jié)構(gòu)蛋白VP60具有自我組裝形成病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)的特點,利用含SUMO蛋白標(biāo)簽的原核表達(dá)技術(shù),首次利用大腸桿菌表達(dá)的重組VP60蛋白在體外制備了VLPs,進(jìn)一步制備RHDV VLPs疫苗。同時,利用VLPs作為免疫原接種小鼠,獲得7株抗VP60蛋白單克隆抗體(Monoclonal antibody,Mab),進(jìn)而利用單克隆抗體建立了一種快速、操作簡便、特異性強(qiáng)的用于檢測RHDV的雙抗夾心(double antibody-sandwich,DAS)ELISA方法。首先,我們將RHDV VP60基因克隆并插入原核表達(dá)載體pSMK中,獲得重組質(zhì)粒pSMK-VP60,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21-condon Plus(DE3)-RIL表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中,通過SDS-PAGE分析,重組蛋白在大腸桿菌中部分以可溶性表達(dá),大小約為85kDa。利用鎳柱親和層析方法獲得高純度的重組蛋白His-SUMO-VP60蛋白。Western blot方法顯示該重組蛋白可以被兔抗VP60多克隆抗血清識別。重組VP60蛋白的表達(dá)為下一步研究體外制備VLPs提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。利用特異性SUMO蛋白酶對重組蛋白進(jìn)行酶切和純化,通過電子投射顯微鏡觀察VP60蛋白能夠自我組裝形成直徑約為25~30nm大小的VLPs,其形態(tài)結(jié)構(gòu)類似于親本RHDV粒子。Western blot方法結(jié)果顯示該VLPs可以被兔抗VP60多克隆抗血清識別,表明體外制備VLPs具有和VP60蛋白相似的抗原性;分別將組織滅活疫苗、His-SUMO-VP60、VLPs和PBS免疫實驗兔。以間接ELISA方法檢測結(jié)果顯示VLPs免疫兔后抗體消長規(guī)律同滅活疫苗相類似,抗體呈上升趨勢。同時淋巴細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的水平都明顯高于PBS對照組。以上結(jié)果表明RHDV VLPs具有刺激兔體液免疫和細(xì)胞免疫的能力,具有作為RHD疫苗的潛力。由于RHDV VLPs展現(xiàn)出良好的免疫原性,我們利用VLPs作為免疫原制備了抗VP60單克隆抗體。首先,將VLPs免疫小鼠,加強(qiáng)免疫后將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行了融合。以兔RHDV陽性肝臟研磨液作為檢測抗原,利用間接ELISA方法篩選獲得7株能穩(wěn)定分泌抗VP60單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為4A1,5B2,6F6,9H9,11D4,15C3,16F2。Western blot結(jié)果表明7株抗VP60 Mabs都可與His-SUMO-VP60蛋白反應(yīng);IFA結(jié)果表明7株Mabs都可以與真核重組表達(dá)質(zhì)粒pSCA1/VP60在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白反應(yīng)。通過抗體配對實驗,確定以9H9為捕獲抗體,辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP)的9H9為檢測抗體建立雙抗夾心ELISA方法。利用單克隆抗體作為捕獲抗體和檢測抗體,提高了檢測方法的特異性,該雙抗夾心ELISA方法對12個RHDV陽性樣品檢測率為100%。利用RT-PCR方法和雙抗夾心ELISA方法對85份兔肝臟樣品進(jìn)行檢測,總符合率為98.8%,表明該雙抗夾心ELISA方法具有高敏感型和特異性,可以用于RHD的臨床檢測。該方法對于臨床診斷RHDV感染提供了有效的檢測方法。
【關(guān)鍵詞】：RHDV 原核表達(dá) 病毒樣顆粒 VP60蛋白 單克隆抗體 雙抗夾心ELISA
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 第一章 引言15-23
• 1.1 兔出血癥和兔出血癥病毒概述15
• 1.2 病毒樣顆粒疫苗概述15-19
• 1.2.1 常用表達(dá)系統(tǒng)16-17
• 1.2.2 病毒樣顆粒的應(yīng)用進(jìn)展17-19
• 1.2.3 存在問題及應(yīng)用前景19
• 1.3 兔出血癥疫苗研究現(xiàn)狀19-21
• 1.3.1 滅活疫苗19
• 1.3.2 亞單位疫苗19-21
• 1.4 兔出血癥診斷方法的研究現(xiàn)狀21-22
• 1.5 基于單克隆抗體的雙抗夾心ELISA診斷方法22
• 1.6 本研究的目的及意義22-23
• 第二章 兔出血癥病毒VP60蛋白的表達(dá)和鑒定23-31
• 2.1 材料23-24
• 2.1.1 質(zhì)粒、菌株和抗體23
• 2.1.2 主要實驗試劑23-24
• 2.1.3 主要儀器24
• 2.2 實驗方法24-27
• 2.2.1 VP60基因的擴(kuò)增24
• 2.2.2 pSMK-VP60原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定24-26
• 2.2.3 重組VP60蛋白的表達(dá)和純化26-27
• 2.2.4 重組VP60蛋白的純化27
• 2.2.5 SDS-PAGE和Western blotting檢測27
• 2.3 結(jié)果27-30
• 2.3.1 VP60基因的擴(kuò)增27-28
• 2.3.2 重組質(zhì)粒pSMK-VP60在DH5α 中的PCR鑒定28-29
• 2.3.3 重組VP60蛋白的表達(dá)29
• 2.3.4 重組VP60蛋白的反應(yīng)原性鑒定29
• 2.3.5 重組VP60蛋白的可溶性分析及純化29-30
• 2.4 討論30-31
• 第三章 VP60蛋白VLPs的制備和免疫學(xué)性檢測31-39
• 3.1 材料與方法31-32
• 3.1.1 試驗動物，滅活疫苗，兔抗RHDV陽性血清、陰性血清31
• 3.1.2 主要實驗試劑31
• 3.1.3 主要儀器31-32
• 3.2 實驗方法32-34
• 3.2.1 VLPs的制備32
• 3.2.2 重組VP60蛋白的酶切效果與VLPs形成的鑒定32
• 3.2.3 SPF兔免疫試驗和攻毒保護(hù)實驗32-34
• 3.3 結(jié)果34-37
• 3.3.1 體外制備VLPs的鑒定結(jié)果34-35
• 3.3.2 VP60特異性抗體水平的檢測35-36
• 3.3.3 淋巴細(xì)胞增殖試驗檢測36
• 3.3.4 白介素-4 細(xì)胞因子檢測36-37
• 3.3.5 干擾素-γ 水平的檢測37
• 3.3.6 動物保護(hù)試驗37
• 3.4 討論37-39
• 第四章 RHDV VP60蛋白單克隆抗體的制備與鑒定39-44
• 4.1 材料與方法39
• 4.1.1 細(xì)胞和實驗動物39
• 4.1.2 主要試劑39
• 4.2 實驗方法39-41
• 4.2.1 動物免疫39
• 4.2.2 間接ELISA方法檢測小鼠血清中抗VP60蛋白效價39-40
• 4.2.3 細(xì)胞融合40
• 4.2.4 有限稀釋、克隆陽性雜交瘤細(xì)胞40
• 4.2.5 腹水的制備40
• 4.2.6 單克隆抗體亞型的測定40-41
• 4.2.7 Western blotting分析單克隆抗體生物學(xué)特性41
• 4.2.8 間接免疫熒光分析單克隆抗體生物學(xué)特性41
• 4.3 結(jié)果41-43
• 4.3.1 融合前小鼠血清抗VP60蛋白抗體效價測定41
• 4.3.2 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選41-42
• 4.3.3 單克隆抗體亞型的鑒定42
• 4.3.4 Western blotting方法鑒定單克隆抗體與VP60蛋白的互相作用42-43
• 4.3.5 間接免疫熒光方法鑒定單克隆抗體與VP60蛋白的互相作用43
• 4.4 討論43-44
• 第五章 雙抗夾心ELISA檢測RHDV方法的初步的建立44-52
• 5.1 材料和方法44-46
• 5.1.1 抗體及樣品44
• 5.1.2 試劑44-45
• 5.1.3 樣品的處理45
• 5.1.4 抗體配對實驗45
• 5.1.5 確定捕獲抗體和檢測抗體最佳工作濃度45
• 5.1.6 確定最適包被條件45
• 5.1.7 確定最佳封閉劑45
• 5.1.8 確定最佳封閉條件45-46
• 5.1.9 確定最佳酶標(biāo)抗體稀釋液46
• 5.1.10 確定陰陽性標(biāo)準(zhǔn)46
• 5.1.11 特異性試驗46
• 5.1.12 臨床樣品檢測試驗46
• 5.2 結(jié)果46-50
• 5.2.1 抗體配對試驗46
• 5.2.2 雙抗夾心ELISA法的建立46-48
• 5.2.3 最適包被條件的確定48
• 5.2.4 最適封閉劑的確定48
• 5.2.5 最適封閉條件的確定48
• 5.2.6 最適酶標(biāo)抗體稀釋液的確定48-49
• 5.2.7 臨界值的確定49
• 5.2.8 試驗的特異性49-50
• 5.2.9 臨床樣品檢測結(jié)果分析50
• 5.3 討論50-52
• 第六章 全文結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 致謝60-61
• 作者簡介61

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 程晉霞;曾靜;張蕾;張琳;張海予;劉雪松;曹棟;;霍亂弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA的建立[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2013年11期

2 李超美;王芳;蔡少平;任雪楓;胡波;范志宇;徐為中;何孔旺;;檢測兔出血癥病毒抗體間接ELISA方法的建立[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報;2010年03期

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本文編號：1074473