本文關(guān)鍵詞：豬塞內(nèi)加谷病毒（SVV）的分離鑒定及致病性研究

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【摘要】：豬塞內(nèi)加谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)屬于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)Senecavirus病毒屬成員,可引起豬鼻鏡及蹄冠處出現(xiàn)水皰、潰爛創(chuàng)面從而導(dǎo)致跛足甚至死亡。本研究采用傳代細(xì)胞(豬腎細(xì)胞)從豬組織器官研磨物中分離出4株SVV,分別命名為SVV CH-01-2015、SVVCH-02-2015、SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015。并對(duì)4株SVV中國(guó)分離株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定。根據(jù)發(fā)表在GenBank SVV保守序列3C基因,設(shè)計(jì)特異性引物和探針;構(gòu)建含3C基因序列的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品,建立針對(duì)SVV檢測(cè)的TaqManReal-Time PCR檢測(cè)方法。將SVV細(xì)胞分離株攻毒4日齡健康仔豬,觀察臨床癥狀、病理變化,檢測(cè)感染動(dòng)物組織器官中的病毒載量。病毒分離鑒定結(jié)果表明:病毒分離液在第一代24h后即可產(chǎn)生CPE,隨著傳代次數(shù)的增加,出現(xiàn)CPE的時(shí)間縮短,細(xì)胞病變程度亦隨之加劇,且可在PK-15細(xì)胞上穩(wěn)定增殖。全基因組序列比對(duì)結(jié)果表明,SVV CH-01-2015與SVV CH-02-2015、CH-03-2015、SVV CH-04-2015的相似性為97.6%;SVV CH-02-2015與SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015的相似性為99.9%;SVV CH-03-2015與SVV CH-04-2015的相似性為100%。4株SVV中國(guó)分離株與2008年美國(guó)分離株SVV-001相比,相似性為94.3%-94.4%之間;SVV CH-01-2015與2015年美國(guó)新分離株USA/IA46008/2015和USA/IA40380/2015相似性均為96.8%;SVV CH-02-2015、SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015與2015年美國(guó)新分離株USA/IA46008/2015和USA/IA40380/2015相似性均為98.0%;SVV CH-01-2015與2015年巴西新分離株SVV/BRA/GO3/2015、SVV/BRA/MG1/2015、SVV/BRA/MG2/2015相似性均為97.1%;SVV CH-02-2015、SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015與2015年巴西新分離株SVV/BRA/GO3/2015、SVV/BRA/MG1/2015、SVV/BRA/MG2/2015相似性均為98.2%;SVV CH-01-2015與SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015與加拿大株11-55910-3相似性均為96.7%;SVV CH-02-2015與加拿大株11-55910-3相似性均為96.6%。4株SVV中國(guó)分離株均位于Senecavirus病毒屬,與Senecavirus病毒屬毒株同源性最高,由此可以確定所分離到的4株均屬于Senecavirus病毒屬。TaqMan Real-Time PCR檢測(cè)方法的結(jié)果顯示,TaqMan Real-Time PCR用標(biāo)準(zhǔn)品所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(R2)達(dá)到0.999以上;可以檢測(cè)到標(biāo)準(zhǔn)品下限濃度為1×102copies/μL;只以SVV的cDNA為模板的反應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性熒光信號(hào),而以其它病毒的cDNA/DNA為模板所進(jìn)行的Real-Time PCR均未檢測(cè)到陽(yáng)性熒光信號(hào);組內(nèi)與組間試驗(yàn)的變異系數(shù)均在0.96以下。本研究建立的TaqMan Real-Time PCR方法靈敏度高,特異性強(qiáng),重復(fù)性好。TaqMan Real-Time PCR檢測(cè)方法的成功建立,為SVV的定性檢測(cè)和定量分析提供了有效的技術(shù)平臺(tái)。動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果表明:(1)運(yùn)用人工感染方式成功在4日齡仔豬身上發(fā)現(xiàn)臨床癥狀和病理變化,證明SVV對(duì)仔豬具有致病性。(2)通過(guò)同居感染處理證明SVV可能是一種接觸傳染病且傳播速度較快。(3)SVV可在4日齡仔豬內(nèi)體成功復(fù)制且病毒可能在肺、脾、扁桃體、腦部和心臟中成功復(fù)制。
【關(guān)鍵詞】：Seneca Valleyvirus 序列分析 TaqMan熒光定量PCR 致病性
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 1 前言12-17
• 1.1 概況12
• 1.2 病毒的形態(tài)12
• 1.3 病毒的基因組結(jié)構(gòu)及功能12-15
• 1.4 SVV的發(fā)病情況15-16
• 1.5 診斷方法16
• 1.6 本研究的目的和意義16-17
• 2 Seneca Valleyvirus的分離和全基因組序列測(cè)定與分析17-35
• 2.1 材料與方法17-26
• 2.1.1 樣品17
• 2.1.2 細(xì)胞17
• 2.1.3 基因工程菌17
• 2.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒分離培養(yǎng)相關(guān)試劑17
• 2.1.5 分子克隆相試劑與試劑盒17-18
• 2.1.6 主要儀器設(shè)備18-19
• 2.1.7 SVV臨床樣品的檢測(cè)19-20
• 2.1.8 SVV的分離鑒定20-21
• 2.1.9 SVV株的全基因序列測(cè)定與分析21-25
• 2.1.10 SVV的純化25-26
• 2.1.11 SVV形態(tài)的電鏡觀察26
• 2.2 結(jié)果與分析26-32
• 2.2.1 SVV感染樣品的鑒定結(jié)果26-27
• 2.2.2 SVV的分離鑒定結(jié)果27-28
• 2.2.3 四株SVV全基因序列測(cè)定與分析結(jié)果28-32
• 2.2.4 SVV的純化結(jié)果32
• 2.2.5 SVV的電鏡觀察結(jié)果32
• 2.3 討論32-34
• 2.3.1 用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)SVV在PK-15 細(xì)胞上穩(wěn)定傳代32-33
• 2.3.2 SVV分離株基因序列分析33-34
• 2.4 結(jié)論34-35
• 3 Seneca Valleyvirus Taq Man熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立35-45
• 3.1 材料與方法35-36
• 3.1.1 病毒、菌種和質(zhì)粒35
• 3.1.2 主要儀器35-36
• 3.1.3 主要藥品及試劑36
• 3.2 方法36-40
• 3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的制備36-39
• 3.2.2 熒光定量PCR方法的建立39
• 3.2.3 Taq Man Real-Time PCR 條件最優(yōu)化39
• 3.2.4 Taq Man Real-Time PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作39
• 3.2.5 Taq Man Real-Time PCR 的敏感性試驗(yàn)39
• 3.2.6 Taq Man Real-Time PCR 的特異性試驗(yàn)39
• 3.2.7 Taq Man Real-Time PCR 的重復(fù)性試驗(yàn)39-40
• 3.3 結(jié)結(jié)果40-43
• 3.3.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備40
• 3.3.2 Taq Man Real-Time PCR條件最優(yōu)化40
• 3.3.3 Taq Man Real-Time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作40-41
• 3.3.4 Taq Man Real-Time PCR敏感性試驗(yàn)41-42
• 3.3.5 Taq Man Real-Time PCR的特異性試驗(yàn)42
• 3.3.6 Taq Man Real-Time PCR的重復(fù)性試驗(yàn)42-43
• 3.4 討論43-44
• 3.5 結(jié)論44-45
• 4 Seneca Valleyvirus細(xì)胞分離毒株對(duì)仔豬致病性研究45-57
• 4.1 材料與方法45-48
• 4.1.1 病毒、菌種和質(zhì)粒45
• 4.1.2 主要儀器45-46
• 4.1.3 主要藥品及試劑46
• 4.1.4 SVV細(xì)胞分離毒株TCID50的測(cè)定46-47
• 4.1.5 四日齡仔豬攻毒試驗(yàn)47
• 4.1.6 組織器官病理組織學(xué)觀察47
• 4.1.7 組織器官病毒含量的測(cè)定47-48
• 4.2 結(jié)果48-54
• 4.2.1 SVV細(xì)胞分離毒株TCID50測(cè)定結(jié)果48
• 4.2.2 豬肛拭子和鼻拭子病毒檢測(cè)結(jié)果48
• 4.2.3 臨床癥狀和剖檢病變觀察48-50
• 4.2.4 組織器官組織病理學(xué)觀察結(jié)果50-53
• 4.2.5 組織器官中病毒含量測(cè)定結(jié)果53-54
• 4.3 討論54-56
• 4.4 結(jié)論56-57
• 全文總結(jié)57-58
• 致謝58-59
• 參考文獻(xiàn)59-61
• 附錄：碩士期間論文發(fā)表情況61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1063562