本文關(guān)鍵詞：豬δ冠狀病毒抑制IFN-β產(chǎn)生的機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 豬δ冠狀病毒(PDCoV) 生長特性 天然免疫應(yīng)答 I型干擾素 RIG-I信號(hào)通路

【摘要】：豬δ冠狀病毒(PDCoV)屬于冠狀病毒科δ冠狀病毒屬,能造成母豬和仔豬的腹瀉、嘔吐、脫水,嚴(yán)重者可致死。自2014年初美國俄亥俄州的豬場爆發(fā)母豬和仔豬腹瀉病以來,該病毒迅速傳播至美國其它州以及韓國、加拿大和中國大陸,給養(yǎng)豬業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。干擾素以及干擾素誘導(dǎo)的細(xì)胞抗病毒天然免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗病毒入侵的重要防御機(jī)制。為了抵抗干擾素的抗病毒效應(yīng),冠狀病毒在其進(jìn)化過程中能采用不同的策略來逃避宿主的天然免疫反應(yīng),其中α冠狀病毒、β冠狀病毒以及γ冠狀病毒逃避天然免疫的分子機(jī)制已經(jīng)得到廣泛研究,因此我們推測PDCoV也進(jìn)化出了逃避抗病毒免疫反應(yīng)的策略。為了揭示PDCoV感染與天然免疫之間的關(guān)系及機(jī)制,本文對(duì)PDCoV感染細(xì)胞后干擾素的產(chǎn)生情況及其信號(hào)通路展開了研究。具體內(nèi)容如下:1.PDCoV在LLC-PK1細(xì)胞上生長特性的研究首先我們研究不同胰酶濃度的培養(yǎng)基對(duì)PDCoV引起LLC-PK1細(xì)胞病變的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCoV對(duì)LLC-PK1細(xì)胞的感染需要一定濃度的胰酶,且各時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)的病變程度和細(xì)胞脫落程度都隨胰酶濃度增加而加大,其中當(dāng)使用胰酶濃度為10ug/m L的培養(yǎng)基時(shí),PDCoV感染的LLC-PK1細(xì)胞在24 h開始出現(xiàn)病變,但病變程度輕微,且無細(xì)胞脫落;同時(shí)我們還研究了PDCoV引起的細(xì)胞病變與接種劑量的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCoV引起的LLC-PK1細(xì)胞的病變時(shí)間與病變程度都隨接種劑量的增加而增大,當(dāng)接種量為0.01 moi時(shí),細(xì)胞在24 h開始出現(xiàn)病變,但病變程度輕微,且無細(xì)胞脫落,與上述胰酶濃度摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致;間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDCoV感染LLC-PK1細(xì)胞后感染率隨時(shí)間的推移而增大,在感染24 h后感染率能達(dá)到較高水平且無細(xì)胞脫落;病毒滴定測定結(jié)果顯示病毒滴度在感染過程中呈現(xiàn)逐步上升趨勢,在感染24 h后病毒滴度能達(dá)到107.2 TCID50/mL。因此PDCoV感染LLC-PK1細(xì)胞后在24 h能達(dá)到較高感染率且無細(xì)胞脫落,它將作為我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)所選擇的最佳時(shí)間點(diǎn)。2.PDCoV感染后IFN-β、NF-κB和IRF3的產(chǎn)生情況研究采用IFN-β啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測PDCoV感染LLC-PK1細(xì)胞之后IFN-β的表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDCoV感染不僅不能激活I(lǐng)FN-β的轉(zhuǎn)錄,并且還能抑制SeV或poly(I:C)誘導(dǎo)的IFN-β的轉(zhuǎn)錄,且呈現(xiàn)PDCoV接種劑量依賴性;進(jìn)一步采用NF-κB和IRF3啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測PDCoV感染LLC-PK1細(xì)胞之后NF-κB和IRF3的表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDCoV感染不能激活NF-κB和IRF3的啟動(dòng)子活性,并且還能抑制SeV或poly(I:C)誘導(dǎo)的NF-κB啟動(dòng)子活性和IRF3啟動(dòng)子活性。該結(jié)果表明PDCoV能通過抑制NF-κB和IRF3轉(zhuǎn)錄因子的活性從而抑制IFN-β啟動(dòng)子的活性。3.PDCoV抑制IFN-β產(chǎn)生的信號(hào)通路研究SeV和poly(I:C)是RIG-I樣受體介導(dǎo)的IFN-β信號(hào)通路中的關(guān)鍵誘導(dǎo)物,因此我們推測PDCoV抑制SeV或poly(I:C)誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生很有可能是通過阻斷了RIG-I信號(hào)通路上的某個(gè)信號(hào)分子。為了驗(yàn)證這種可能性及其分子機(jī)制,我們研究鑒定了PDCoV阻斷SeV或poly(I:C)誘導(dǎo)的IFN-β轉(zhuǎn)錄的靶蛋白。在RIG-I信號(hào)通路的分析中,通過對(duì)RIG-I、RIG-IN、MDA5、IPS-1、TBK1、IKKε、IRF3和IRF3(5D)的超表達(dá)分析,我們發(fā)現(xiàn)PDCoV感染能抑制IRF3及其上游信號(hào)分子(RIG-I/RIG-IN、MDA-5、IPS-1、TBK1和IKKε)誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性,但不會(huì)影響IRF3的組成激活型IRF3(5D)激活的IFN-β啟動(dòng)子活性,表明PDCoV能夠靶向IRF3阻斷RIG-I信號(hào)通路,從而抑制IFN-β的轉(zhuǎn)錄。4.PDCoV感染后IRF3和P65的磷酸化與核轉(zhuǎn)位研究PDCoV能夠抑制SeV誘導(dǎo)的IRF3和NF-κB的啟動(dòng)子活性,而磷酸化與核轉(zhuǎn)位是IRF3和NF-κB(P65)活化的標(biāo)志,因此我們探討了PDCoV感染對(duì)IRF3和NF-κB的磷酸化與核轉(zhuǎn)位的影響。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PDCoV感染能顯著抑制SeV誘導(dǎo)的IRF3和P65的磷酸化;間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PDCoV感染不能引起IRF3和P65發(fā)生核轉(zhuǎn)位,并且還能抑制由SeV引起的IRF3和P65的核轉(zhuǎn)位。表明PDCoV能通過抑制IRF3和P65的磷酸化與核轉(zhuǎn)位從而來抑制SeV誘導(dǎo)的IRF3和NF-κB的啟動(dòng)子活性。
【關(guān)鍵詞】：豬δ冠狀病毒(PDCoV) 生長特性 天然免疫應(yīng)答 I型干擾素 RIG-I信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 縮略語表（Abbreviation）11-13
• 第1章 文獻(xiàn)綜述13-25
• 1.1 冠狀病毒簡介13
• 1.2 豬 δ 冠狀病毒簡介13-14
• 1.3 PDCoV的流行病學(xué)與致病性14-15
• 1.4 PDCoV的體外生長特性15-17
• 1.5 PDCoV的分子生物學(xué)特征17
• 1.6 天然免疫簡介17-18
• 1.7 干擾素簡介18-19
• 1.8 抗病毒天然免疫19-23
• 1.8.1 RIG/MDA5介導(dǎo)的抗病毒天然免疫19-20
• 1.8.2 Toll樣受體介導(dǎo)的抗病毒天然免疫20-22
• 1.8.3 Jak/STAT介導(dǎo)的抗病毒天然免疫22-23
• 1.9 病毒逃避天然免疫23-25
• 1.9.1 病毒逃避TLR和RIG-I/MDA5信號(hào)通路的策略23
• 1.9.2 冠狀病毒逃避天然免疫的策略23-25
• 第2章 研究目的和意義25-26
• 第3章 材料和方法26-36
• 3.1 試驗(yàn)材料26-30
• 3.1.1 毒株與細(xì)胞26
• 3.1.2 載體與質(zhì)粒26-27
• 3.1.3 主要試劑27-28
• 3.1.4 培養(yǎng)基及其配制28
• 3.1.5 主要緩沖液及其配制28-29
• 3.1.6 主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備29-30
• 3.1.7 分子生物學(xué)分析軟件30
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法30-36
• 3.2.1 質(zhì)粒的小量制備30-31
• 3.2.2 質(zhì)粒的大量制備31-32
• 3.2.3 質(zhì)粒DNA的定量32
• 3.2.4 PDCoV的增殖32
• 3.2.5 半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量（ TCID_(50)）測定32
• 3.2.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染32-33
• 3.2.7 雙熒光素酶報(bào)告檢測實(shí)驗(yàn)33
• 3.2.8 Western blot實(shí)驗(yàn)33-35
• 3.2.9 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)35
• 3.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法35-36
• 第4章 結(jié)果與分析36-48
• 4.1 PDCoV在LLC-PK1細(xì)胞上的生長特性36-39
• 4.1.1 不同胰酶濃度對(duì)PDCoV生長特性的影響36-37
• 4.1.2 不同接種量的PDCoV對(duì)LLC-PK1細(xì)胞產(chǎn)生的病變情況37
• 4.1.3 PDCoV感染LLC-PK1細(xì)胞后感染數(shù)量隨時(shí)間的變化37-39
• 4.1.4 PDCoV在LLC-PK1細(xì)胞上的一步生長曲線39
• 4.2 PDCoV抑制IFN-β 產(chǎn)生的分子機(jī)制研究39-48
• 4.2.1 PDCoV感染不能激活I(lǐng)FN-β 的轉(zhuǎn)錄39-40
• 4.2.2 PDCoV感染抑制SeV或poly (I:C)誘導(dǎo)的IFN-β 的轉(zhuǎn)錄40-42
• 4.2.3 PDCoV感染抑制SeV或poly (I:C)誘導(dǎo)的NF-κB和IRF3的活化42-43
• 4.2.4 PDCoV抑制RIG-I信號(hào)通路中IRF3的活性43-45
• 4.2.5 PDCoV感染抑制SeV誘導(dǎo)的IRF3和P65的磷酸化與核轉(zhuǎn)位45-48
• 第5章 討論與結(jié)論48-54
• 5.1 討論48-52
• 5.1.1 PDCoV生長特性的研究48-50
• 5.1.2 PDCoV逃避天然免疫的分子機(jī)制50-51
• 5.1.3 PDCoV逃避天然免疫的臨床意義51-52
• 5.2 結(jié)論52-54
• 參考文獻(xiàn)54-62
• 致謝62

【相似文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張磊;泛素特異性蛋白酶USP2b通過靶向TBK1負(fù)向調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生和抗病毒反應(yīng)[D];山東大學(xué);2014年

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1 羅靜宜;豬δ冠狀病毒抑制IFN-β產(chǎn)生的機(jī)制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 陳小華;人IFN-β基因復(fù)制缺陷型腺病毒載體的構(gòu)建[D];鄭州大學(xué);2006年

3 王朋;抗豬IFN-β和IFN-γ單克隆抗體的制備及豬IFN-β雙抗體夾心ELISA方法的初步建立[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 唐博;IFN-β對(duì)豬血凝性腦脊髓炎病毒感染巨噬細(xì)胞的影響及其抗病毒效果研究[D];吉林大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1063394