本文關(guān)鍵詞：2011-2015我國(guó)部分地區(qū)鴿源新城疫病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及鴿新城疫疫苗VIb-I4的免疫效力試驗(yàn)

  更多相關(guān)文章： 鴿 新城疫病毒 遺傳進(jìn)化 疫苗 免疫效力

【摘要】：鴿新城疫(Newcastle Disease, ND)是由鴿新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)引起的一種高度接觸性病毒性傳染病,其臨床表現(xiàn)與雞新城疫非常相似。鴿新城疫于上世紀(jì)80年代傳入我國(guó),對(duì)我國(guó)養(yǎng)鴿業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成了巨大威脅。為了解鴿群中NDV的遺傳變異規(guī)律,本文對(duì)2011-2015年從我國(guó)部分地區(qū)分離的11株鴿NDV進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析,并測(cè)定了部分毒株的生物學(xué)特性。同時(shí)為進(jìn)一步探究鴿源NDV的致病機(jī)理并豐富其基因信息庫(kù),本研究選取了不同地點(diǎn)分離到的2株毒力不一致的鴿源NDV進(jìn)行了全基因組序列的測(cè)定和分析。另外,根據(jù)鴿源NDV的分子流行病學(xué)研究結(jié)果,針對(duì)當(dāng)前缺少專門用于鴿新城疫預(yù)防疫苗的現(xiàn)狀,本文還對(duì)我室研制的鴿新城疫疫苗株VIb-I4開(kāi)展了免疫效力試驗(yàn)研究。1.鴿源新城疫病毒的分離鑒定及分子流行病學(xué)2011-2015年從我國(guó)部分地區(qū)發(fā)病鴿的病料中共分離到鴿新城疫病毒11株。F及HN基因序列的遺傳進(jìn)化分析表明所有分離株均屬基因VIb亞型,證實(shí)目前我國(guó)鴿群中的ND仍然由VIb亞型NDV引起,該亞型毒株具有明顯的宿主親嗜性。11株鴿源NDV的F及HN基因核苷酸序列的同源性分別是94.3-99.3%和93.9-99.9%,與歐洲近期型毒株(EU/re)處于同一分支。分離株與目前廣泛使用的疫苗株La Sota遺傳距離較遠(yuǎn),11株病毒與La Sota的F及HN基因核苷酸序列同源性分別為83.9-84.9%和82.7-83.6%,氨基酸序列同源性分別為88.4-89.4%和87.4-88.5%。11株NDV的F蛋白裂解位點(diǎn)序列均為112R-R-Q-K-R-F117,呈典型的強(qiáng)毒特征,但這11株病毒的MDT值從50h到114h不等,ICPI從0.98到1.51不等,說(shuō)明毒株間的毒力差異較大,因此F蛋白裂解位點(diǎn)序列并不是新城疫病毒毒力的唯一決定因素。分離株與La Sota相比在HN蛋白抗原區(qū)及附近位點(diǎn)存在12個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異,其中4個(gè)為保守性替換,其余分別涉及極性,電荷,結(jié)構(gòu)的改變。第347位氨基酸位于HN蛋白的線性抗原表位,分離株與La Sota相比在該位點(diǎn)發(fā)生了E347G的替換,并且單抗6B1與分離株反應(yīng)的HI效價(jià)也比其與La Sota低6個(gè)滴度。病毒中和試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離株NT-23-11-Pi與La Sota的抗原相似系數(shù)R值為0.42,證明兩者間存在顯著的抗原性差異。對(duì)分離自不同地區(qū)且毒力有差異的NT-23-11-Pi及ZJ-08-13-Pi進(jìn)行全基因組序列測(cè)定,結(jié)果表明兩株病毒基因組全長(zhǎng)為15192nt,遺傳進(jìn)化分析表明兩株病毒處于EU/re這個(gè)分支。兩株病毒NP、P、M、F、HN、L蛋白氨基酸序列的同源性分別為為99%、97%、99.5%、98.6%、99.5%和99.6%,共有25個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)涉及到極性及結(jié)構(gòu)的變化,這些位點(diǎn)為VIb亞型NDV毒力分子機(jī)制的研究提供了有益參考。2.鴿新城疫滅活疫苗VIb-I4的免疫效力試驗(yàn)?zāi)壳拔覈?guó)對(duì)新城疫的防控主要依靠免疫接種,但目前我國(guó)尚無(wú)針對(duì)鴿新城疫的疫苗產(chǎn)品。前期,本室利用反向遺技術(shù)成功研制出了專用于鴿新城疫預(yù)防的滅活疫苗VIb-I4,為了加速該疫苗的產(chǎn)業(yè)化,本文對(duì)其開(kāi)展了鴿新城疫滅活疫苗(VIb-I4)免疫效力試驗(yàn)研究。首先將疫苗株VIb-I4在雞胚上連續(xù)傳15代,測(cè)定第1、5、10、15代次病毒的毒力和F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸序列,數(shù)據(jù)顯示疫苗株VIb-I4經(jīng)雞胚連續(xù)傳代后,其毒力測(cè)定指標(biāo)和F蛋白裂解位點(diǎn)序列均符合典型的弱毒特征,表明疫苗株具有良好的遺傳穩(wěn)定性；同時(shí)疫苗毒株在雞胚上具有較強(qiáng)的繁殖性能,疫苗毒尿囊液的HA效價(jià)至91og2,病毒含量高于109.0EID50/0.1ml。在生物學(xué)特性測(cè)定的基礎(chǔ)上,我們選取了4株VIb亞型NDV分離株對(duì)鴿進(jìn)行致病性實(shí)驗(yàn),并從中篩選獲得了用于疫苗效力試驗(yàn)的檢驗(yàn)強(qiáng)毒株NT-23-11-Pi,該毒株以106EID5o的劑量攻毒時(shí)可導(dǎo)致非免疫鴿產(chǎn)生80%的死亡率,試驗(yàn)鴿在攻毒后的第15天仍可檢測(cè)到排毒。最小免疫劑量試驗(yàn)結(jié)果表明VIb-I4滅活疫苗的最小免疫為200μl,以該劑量免疫后5周,免疫鴿ND平均抗體效價(jià)可達(dá)到71og2以上,并可有效抵御檢驗(yàn)強(qiáng)毒的攻擊。另外,與傳統(tǒng)疫苗株La Sota滅活疫苗相比,以VIb-I4研制的滅活疫苗免疫鴿后誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的效價(jià)高,具備更強(qiáng)的免疫保護(hù)效力,因此該滅活疫苗顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：鴿 新城疫病毒 遺傳進(jìn)化 疫苗 免疫效力
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.39
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 符號(hào)說(shuō)明10-12
• 綜述 鴿新城疫研究進(jìn)展12-23
• 1. 新城疫病毒概述12
• 2. 新城疫病毒的毒力12-13
• 3. 新城疫病毒各基因及其編碼的蛋白13-17
• 4. 鴿新城疫研究進(jìn)展17-21
• 4.1 鴿新城疫的流行病學(xué)17-18
• 4.2 鴿新城疫的臨床癥狀18
• 4.3 PPMV-1的毒力18-20
• 4.4 PPMV-1的診斷20-21
• 5. 鴿新城疫疫苗研究21-23
• 第一章 2011-2015年我國(guó)部分地區(qū)鴿源新城疫病毒分子流行病學(xué)研究23-45
• 1 材料23-24
• 1.1 病毒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞23
• 1.2 主要試劑23-24
• 1.3 主要儀器24
• 1.4 分子生物學(xué)軟件24
• 2. 方法24-33
• 2.1 病毒的分離與鑒定24
• 2.2 病毒的純化24
• 2.3 病毒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄24-25
• 2.4 PCR反應(yīng)25-26
• 2.5 PCR產(chǎn)物回收和測(cè)序26
• 2.6 病毒F基因及HN基因片段的序列分析26-27
• 2.7 病毒毒力測(cè)定27
• 2.8 分離株與疫苗株LaSota株的抗原性差異27-28
• 2.9 兩株VIb亞型NDV全基因組序列的測(cè)定28-33
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-42
• 3.1 病毒的分離鑒定33
• 3.2 F基因序列分析33-34
• 3.3 HN基因序列分析34-35
• 3.4 HN基因序列分析35-37
• 3.5 全基因序列分析37-42
• 4. 討論42-45
• 第二章 新鴿新城疫疫苗VIb-I4的免疫效力試驗(yàn)45-67
• 1 材料45-46
• 1.1 病毒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)45
• 1.2 主要試劑45
• 1.3 主要儀器45-46
• 1.4 分子生物學(xué)軟件46
• 2 方法46-50
• 2.1 疫苗株VIb-I4在雞胚上的連續(xù)傳代46
• 2.2 傳代病毒生物學(xué)特性的測(cè)定及F基因序列的擴(kuò)增46
• 2.3 檢驗(yàn)強(qiáng)毒的篩選46
• 2.4 光定量PCR檢測(cè)方法的建立46-49
• 2.5 最小免疫劑量試驗(yàn)49-50
• 2.6 VIb-I4與LaSota免疫效果對(duì)比試驗(yàn)50
• 3. 結(jié)果50-58
• 3.1 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)50
• 3.2 熒光定量檢測(cè)方法的建立50-53
• 3.3 檢驗(yàn)強(qiáng)毒的篩選53-56
• 3.4 最小免疫劑量試驗(yàn)56-58
• 3.5 VIb-I4與LaSota免疫效果對(duì)比試驗(yàn)58
• 4. 討論58-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 全文小結(jié)67-68
• 致謝68-69
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄69-70

【相似文獻(xiàn)】

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