本文關(guān)鍵詞：腸外致病性大腸桿菌icmF基因功能研究和侵入腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因的篩選

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【摘要】：腸外致病性大腸桿菌是一類在特定情況下能引起宿主腸道以外組織感染的病原菌,主要引發(fā)肺部感染、泌尿系統(tǒng)感染和腦膜炎等。盡管已經(jīng)有很多毒力因子被報(bào)道參與了上述致病過(guò)程,但仍有許多細(xì)節(jié)未得到清楚的解釋。細(xì)菌VI型分泌系統(tǒng)已被鑒定存在于包括腸外致病性大腸桿菌在內(nèi)的多種致病菌中,在細(xì)菌致病過(guò)程中起到重要作用。本課題利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的大腸桿菌VI型分泌系統(tǒng)基因缺失株Δhcp1-3和新構(gòu)建的icmF基因缺失株ΔicmF,研究icmF基因在豬腸外致病性大腸桿菌PCN033中的作用。主要取得以下結(jié)果:(1)成功利用正反篩選系統(tǒng)構(gòu)建了icmF基因敲除突變株,并改進(jìn)了突變株的篩選方法。(2)表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,T6SS相關(guān)基因缺失并不影響細(xì)菌的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和抗藥能力,但能顯著增強(qiáng)細(xì)菌形成生物被膜的能力。(3)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,T6SS功能的缺失導(dǎo)致細(xì)菌粘附、侵入上皮細(xì)胞能力增強(qiáng)。另外,T6SS功能的缺失并不影響細(xì)菌對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性,但極顯著的降低了細(xì)菌抵抗巨噬細(xì)胞吞噬和在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的能力。在所有的表型檢測(cè)中,ΔicmF和Δhcp1-3的表現(xiàn)基本相同,可以初步認(rèn)為icmF基因功能與T6SS緊密相關(guān)。為了進(jìn)一步了解致腦膜炎大腸桿菌的致病機(jī)制,本研究進(jìn)一步構(gòu)建了腦膜炎模式菌株RS218的Tn5轉(zhuǎn)座子突變體庫(kù)。以人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞為模型,篩選侵入能力缺陷的突變株。通過(guò)對(duì)764株突變株的篩選,初步獲得33株侵入能力明顯下降的突變株。進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)候選突變株的生長(zhǎng)速率,篩選掉2株生長(zhǎng)速率下降的突變株。經(jīng)細(xì)胞侵入實(shí)驗(yàn)的復(fù)檢,最終獲得31株突變株對(duì)HBMEC的侵入率。采用TAIL-PCR技術(shù),獲得了Tn5插入位置一側(cè)的基因組序列,經(jīng)測(cè)序和序列分析,定位到29個(gè)基因內(nèi)部插入和兩個(gè)基因間插入。其中有一個(gè)突變發(fā)生在已報(bào)道參與細(xì)菌突破血腦屏障的fimH基因內(nèi)。本研究的篩選結(jié)果為后續(xù)大腸桿菌致腦膜炎的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：腸外致病性大腸桿菌 icmF基因 VI型分泌系統(tǒng) 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 轉(zhuǎn)座子突變體庫(kù)
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-8
• 縮略詞表(Abbreviation)8-9
• 第1章 綜述9-16
• 1.1 IV型分泌系統(tǒng)研究進(jìn)展9-13
• 1.1.1 icmF基因研究進(jìn)展9-10
• 1.1.2 T6SS其他結(jié)構(gòu)蛋白10-11
• 1.1.3 T6SS分泌蛋白的挖掘11-12
• 1.1.4 T6SS的功能12-13
• 1.1.5 T6SS研究小結(jié)與展望13
• 1.2 大腸桿菌致腦膜炎的研究進(jìn)展13-16
• 1.2.1 大腸桿菌引發(fā)腦膜炎的過(guò)程14
• 1.2.2 致腦膜炎大腸桿菌的毒力因子14-15
• 1.2.3 大腸桿菌致腦膜炎研究的小結(jié)與展望15-16
• 第2章 腸外致病性大腸桿菌icmF基因的功能研究16-33
• 2.1 目的與意義16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料16-19
• 2.2.1 菌株、細(xì)胞與質(zhì)粒16
• 2.2.2 酶和相關(guān)試劑16-17
• 2.2.3 培養(yǎng)基和試劑的配制17-18
• 2.2.4 儀器和設(shè)備18-19
• 2.2.5 PCR引物19
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法19-24
• 2.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)和細(xì)菌基因組的提取19
• 2.3.2 基因缺失突變株 ΔicmF的構(gòu)建與鑒定19-20
• 2.3.3 基因缺失突變株 ΔicmF的遺傳穩(wěn)定性20
• 2.3.4 基因缺失突變株 ΔicmF的生長(zhǎng)特性20
• 2.3.5 運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)20-21
• 2.3.6 生物被膜形成能力的檢測(cè)21
• 2.3.7 耐藥性評(píng)估21
• 2.3.8 粘附和侵入內(nèi)皮細(xì)胞能力的檢測(cè)21-22
• 2.3.9 抗巨噬細(xì)胞吞噬及吞噬后存活能力的檢測(cè)22-23
• 2.3.10 巨噬細(xì)胞毒性的檢測(cè)23-24
• 2.4 結(jié)果與分析24-30
• 2.4.1 基因缺失突變株 ΔicmF的構(gòu)建與鑒定24
• 2.4.2 基因缺失突變株 ΔicmF的遺傳穩(wěn)定性24-25
• 2.4.3 基因缺失突變株 ΔicmF的生長(zhǎng)特性25-26
• 2.4.4 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)26
• 2.4.5 生物被膜形成能力檢測(cè)26-27
• 2.4.6 耐藥性測(cè)定27
• 2.4.7 粘附與侵入HBMEC能力的比較27-28
• 2.4.8 抗巨噬細(xì)胞吞噬及吞噬后存活能力檢測(cè)28-29
• 2.4.9 巨噬細(xì)胞毒性檢測(cè)29-30
• 2.5 討論30-32
• 2.6 結(jié)論32-33
• 第3章 RS218突破血腦屏障相關(guān)毒力因子的篩選33-45
• 3.1 目的與意義33
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料33-34
• 3.2.1 菌株、細(xì)胞與質(zhì)粒33
• 3.2.2 酶和相關(guān)試劑33
• 3.2.3 主要儀器和設(shè)備33
• 3.2.4 培養(yǎng)基和試劑的配制33-34
• 3.2.5 PCR引物34
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法34-37
• 3.3.1 突變體庫(kù)的構(gòu)建和質(zhì)量檢測(cè)34-35
• 3.3.2 突變株侵入HBMEC能力的初步篩選35
• 3.3.3 候選突變株生長(zhǎng)能力的檢測(cè)35
• 3.3.4 候選突變株侵入率的測(cè)定35-36
• 3.3.5 TAIL-PCR擴(kuò)增Tn5側(cè)翼序列36-37
• 3.3.6 突變位點(diǎn)定位37
• 3.4 結(jié)果與分析37-42
• 3.4.1 突變體庫(kù)的構(gòu)建和質(zhì)量檢測(cè)37-38
• 3.4.2 突變株侵入HBMEC能力分析38
• 3.4.3 候選突變株生長(zhǎng)能力的檢測(cè)38-39
• 3.4.4 候選突變株侵入率測(cè)定39-40
• 3.4.5 候選突變株突變位點(diǎn)的確定40-42
• 3.5 討論42-44
• 3.6 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-53
• 致謝53

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本文編號(hào)：1050342