本文關(guān)鍵詞：NA蛋白264位潛在糖基化位點(diǎn)對(duì)H9N2禽流感病毒特性的影響

  更多相關(guān)文章： H9N2 NA264潛在糖基化 病毒拯救 生長(zhǎng)曲線 病毒排毒 致病性

【摘要】：對(duì)國(guó)內(nèi)H9N2分離株NA蛋白的序列分析發(fā)現(xiàn),最近國(guó)內(nèi)H9N2分離株NA蛋白在264位出現(xiàn)了一個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)。2000年-2013年間,攜帶該位點(diǎn)的H9N2病毒成逐漸增多趨勢(shì),但是2013年之后有所減少。值得注意的是,具有該N-糖基化位點(diǎn)的H9N2毒株僅被分離于中國(guó),其它國(guó)家只零星存在。這些分析與發(fā)現(xiàn)提示具有該N-糖基化位點(diǎn)的H9N2病毒的出現(xiàn)與流行,可能與國(guó)內(nèi)H9N2病毒的大范圍免疫有關(guān)。然而,目前國(guó)內(nèi)外對(duì)這一潛在的N-糖基化位點(diǎn)的功能和作用尚無(wú)研究報(bào)道。本研究利用反向遺傳操作技術(shù),以NA蛋白264位存在潛在糖基化位點(diǎn)的A/Chicken/Jiangsu/WS1/2012(H9N2) (WS1)病毒以及NA蛋白264位不存在潛在糖基化位點(diǎn)的A/chicken/Beijing/BJ1/2004(H9N2)(BJ)病毒為研究對(duì)象,分別拯救出了rgWSl-NA264N, rgWSl-NA264H, rgBJ-NA264H和rgBJ-NA264N 四個(gè)病毒,并在體內(nèi)外對(duì)該潛在糖基化位點(diǎn)對(duì)H9N2病毒特性的影響進(jìn)行了研究。1.H9N2禽流感病毒NA264N及其變體病毒的拯救本研究在發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)H9N2分離株NA蛋白264位存在潛在N-糖基化位點(diǎn)且該位點(diǎn)呈流行趨勢(shì)的基礎(chǔ)上,為研究該位點(diǎn)對(duì)H9N2病毒特性的影響,以WS1病毒和BJ病毒為研究對(duì)象,利用重組酶ExnaseTM Ⅱ克隆技術(shù)以及流感病毒反向遺傳操作技術(shù),成功構(gòu)建出了可以拯救WS1病毒的8質(zhì)粒系統(tǒng)以及BJ病毒的HA和NA基因,各質(zhì)粒分別命名為WS1-PB2,WS1-PA, WS1-PB1, WS1-HA, WS1-, NP, WS1-NA, WS1-MP, WS1-NS, BJ-HA, BJ-NA。與此同時(shí),本研究利用Overlap PCR突變技術(shù)構(gòu)建了NA基因的兩個(gè)變體,命名為WS1-NA264H, BJ-NA264N。通過(guò)8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T及MDCK細(xì)胞,成功拯救出了四個(gè)病毒,分別命名為rgWS1-NA264N, rgWS1-NA264H, rgBJ-NA264H 和 rgBJ-NA264N。病毒效價(jià)分別為1.58×10-7 TCIDso/m1,5×10-7 TCID50/ml,1.08×10-7 TCID50/ml,1.58×10-7 TCID50/ml。這些病毒的成功拯救為研究H9N2禽流感病毒NA蛋白264位潛在糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒特性的影響提供了重要材料。2. NA264N對(duì)H9N2禽流感病毒特性的影響為研究NA蛋白264位潛在糖基化位點(diǎn)對(duì)H9N2病毒特性的影響,本研究以上述拯救出的四個(gè)病毒(rgWSl-NA264N, rgWSl-NA264H, rgBJ-NA264H, rgBJ-NA264N)為研究對(duì)象,通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)研究NA蛋白264位潛在糖基化位點(diǎn)對(duì)H9N2病毒復(fù)制、排毒及致病性等方面的影響。病毒的體外生長(zhǎng)曲線表明,rgWSl-NA264H以及rgBJ-NA264H均比相應(yīng)的rgWSl-NA264N及rgBJ-NA264N在MDCK細(xì)胞上生長(zhǎng)得快些。在小鼠致病性試驗(yàn)中,雖然rgWSl-NA264H與rgWSl-NA264N病毒在小鼠肺部的含量無(wú)顯著差異且這兩株病毒引起小鼠的體重下降也無(wú)明顯差異,但是rgBJ-NA264H病毒在小鼠肺部的含量卻顯著高于rgBJ-NA264N病毒(3dpi),rgBJ-NA264H感染小鼠平均體重下降最高達(dá)20%,而rgBJ-NA264N感染小鼠體重下降最高僅10%。感染雞喉頭排毒試驗(yàn)表明,rgWSl-NA264H以及rgBJ-NA264H均比相應(yīng)的rgWSl-NA264N及rgBJ-NA264N排毒多。在接觸感染組中,雖然rgWSl-NA264H與rgWSl-NA264N喉頭排毒量無(wú)顯著差異,但是rgBJ-NA264H的喉頭排毒量顯著高于rgBJ-NA264N (6dpi).這些試驗(yàn)結(jié)果表明,H9N2禽流感病毒NA蛋白264位潛在糖基化位點(diǎn)在一定程度上會(huì)影響H9N2病毒的復(fù)制、排毒及其致病性。
【關(guān)鍵詞】：H9N2 NA264潛在糖基化 病毒拯救 生長(zhǎng)曲線 病毒排毒 致病性
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 符號(hào)說(shuō)明9-11
• 文獻(xiàn)綜述11-23
• 1. A型流感病毒概述11-17
• 2. H9N2禽流感病毒的起源17
• 3. H9N2禽流感病毒在國(guó)內(nèi)的流行現(xiàn)狀17-18
• 4. H9N2禽流感病毒的致病性及分子機(jī)制18-20
• 5. H9N2禽流感病毒國(guó)內(nèi)毒株變異與進(jìn)化20-21
• 6. H9N2禽流感病毒在國(guó)內(nèi)的免疫狀況21-22
• 7. 本課題研究的目的和意義22-23
• 研究?jī)?nèi)容一 H9N2禽流感病毒NA264N及其變體病毒的拯救23-37
• 1. 材料23-24
• 1.1 病毒及細(xì)胞23-24
• 1.2 培養(yǎng)基24
• 1.3 主要儀器24
• 2. 方法24-30
• 2.1 流感病毒RNA的提取24-25
• 2.2 cDNA的制備25
• 2.3 引物的設(shè)計(jì)25-26
• 2.4 PCR擴(kuò)增26-27
• 2.5 重組反應(yīng)27
• 2.6 快速克隆方法27-28
• 2.7 反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化涂板28
• 2.8 克隆鑒定28
• 2.9 構(gòu)建264位突變體質(zhì)粒28-29
• 2.10 Overlap PCR法29
• 2.11 病毒的拯救29-30
• 2.12 血凝實(shí)驗(yàn)30
• 2.13 流感病毒TCID_(50)的測(cè)定30
• 3. 結(jié)果30-35
• 3.1 H9N2分離株NA蛋白264位潛在糖基化位點(diǎn)分析30-31
• 3.2 引物的設(shè)計(jì)31-32
• 3.3 流感病毒基因及線性化克隆載體的PCR擴(kuò)增32-33
• 3.4 NA264位突變體質(zhì)粒的構(gòu)建33-34
• 3.5 NA264變體質(zhì)粒的測(cè)序34
• 3.6 利用反向遺傳技術(shù)拯救流感病毒34-35
• 4. 小結(jié)與討論35-37
• 研究?jī)?nèi)容二 NA264N對(duì)H9N2禽流感病毒特性的影響37-47
• 1. 材料37-38
• 1.1 病毒37
• 1.2 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物37-38
• 1.3 培養(yǎng)基38
• 1.4 主要儀器38
• 2. 方法38-40
• 2.1 病毒的擴(kuò)增38
• 2.2 流感病毒TCID_(50)的測(cè)定38-39
• 2.3 流感病毒生長(zhǎng)曲線的測(cè)定39
• 2.4 動(dòng)物試驗(yàn)39-40
• 2.4.1 小鼠致病性實(shí)驗(yàn)39-40
• 2.4.2 SPF雞實(shí)驗(yàn)40
• 2.4.3 HI實(shí)驗(yàn)40
• 3. 結(jié)果40-45
• 3.1 生長(zhǎng)曲線40-41
• 3.2 動(dòng)物試驗(yàn)41-45
• 3.2.1 小鼠致病性實(shí)驗(yàn)41-42
• 3.2.2 SPF雞實(shí)驗(yàn)42-44
• 3.2.3 HI實(shí)驗(yàn)44-45
• 4. 小結(jié)與討論45-47
• 全文總結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文及申請(qǐng)的專利53-54
• 致謝54-55

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