本文關(guān)鍵詞：羊種布魯氏菌hfq突變株毒力及其免疫保護(hù)作用研究

  更多相關(guān)文章： 布病 hfq 毒力相關(guān)因子 宿主免疫反應(yīng) 免疫保護(hù)作用

【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis,簡(jiǎn)稱布病)是一種可累及全身多個(gè)器官與系統(tǒng),有潛在致命危險(xiǎn)的動(dòng)物源性傳染病,給全球經(jīng)濟(jì)與人類健康帶來了巨大威脅。布魯氏菌是兼性胞內(nèi)寄生菌,無質(zhì)粒與外毒素,在宿主細(xì)胞內(nèi)有頑強(qiáng)的生存與繁殖能力。人與動(dòng)物感染后主要呈現(xiàn)流產(chǎn)、不孕、空懷、睪丸炎、關(guān)節(jié)炎及心內(nèi)膜炎等臨床癥狀。細(xì)菌RNA分子伴侶蛋白Hfq (host factor for RNA phage Qβ replicase)是細(xì)菌重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)Hfq不僅影響病原體在各種壓力條件下的生存與繁殖能力,還調(diào)控大量與毒力相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄。為進(jìn)一步明確Hfq與布魯氏菌的胞內(nèi)生存能力、毒力之間的關(guān)系和缺失hfq后對(duì)布魯氏菌免疫保護(hù)作用的影響,進(jìn)行了以下研究：羊種布魯氏菌缺失hfq后對(duì)其毒力影響的研究,主要包含羊種布魯氏菌野生株(16M)、羊種布魯氏菌hfq突變株(16M△hfq)及羊種布魯氏菌hfq互補(bǔ)株(16M△hfq-C) RAW264.7細(xì)胞侵染試驗(yàn)、BALB/c小鼠毒力試驗(yàn)與小鼠感染過程中布魯氏菌毒力相關(guān)基因omp25, omp31, vjbR, htrA, gntR, dnaK轉(zhuǎn)錄情況分析試驗(yàn)。結(jié)果顯示：與16M相比,16M△hfq胞內(nèi)生存能力與毒力都顯著減弱,hfq在感染RAW264.7細(xì)胞中,早期轉(zhuǎn)錄水平高,而在感染小鼠體內(nèi),中后期轉(zhuǎn)錄水平高。在小鼠感染過程中,毒力相關(guān)基因omp25, omp31, vjbR, htrA, gntR, dnaK在16M△hfq中大部分時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄下調(diào),在16M△hfq-C中,轉(zhuǎn)錄得到恢復(fù),提示在感染過程中Hfq對(duì)這些毒力相關(guān)基因主要起正向調(diào)控作用。為研究Hfq對(duì)布魯氏菌免疫保護(hù)作用的影響,進(jìn)行了16M△hfq免疫保護(hù)作用評(píng)價(jià)試驗(yàn)。用16MAhfq感染BALB/c小鼠,PBS做對(duì)照,第45d對(duì)兩組小鼠進(jìn)行16M攻毒試驗(yàn),攻毒后第14d與第28d脫頸處死小鼠,無菌取脾后對(duì)脾臟內(nèi)CFU計(jì)數(shù),初步評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)作用。此外,通過BALB/c小鼠毒力試驗(yàn)與攻毒試驗(yàn),獲得小鼠脾臟cDNA樣本和小鼠血清樣本,采用qPCR法與ELISA法監(jiān)測(cè)感染小鼠不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子的變化。同時(shí),采用ELISA法監(jiān)測(cè)小鼠血清IgG水平。結(jié)果顯示：從攻毒后脾臟CFU計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與PBS組相比,16M△hfq在第14d提供了顯著的免疫保護(hù)作用,差異顯著,在第28d,16M△hfq組小鼠脾臟內(nèi)布魯氏菌已完全被清除。從小鼠細(xì)胞因子與IgG水平監(jiān)測(cè)結(jié)果可知,qPCR法與ELISA法監(jiān)測(cè)到小鼠血清中細(xì)胞因子水平結(jié)果趨勢(shì)匹配。小鼠感染過程中IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4,與16M組相比大部分時(shí)間點(diǎn)均顯著下降,攻毒后4個(gè)細(xì)胞因子水平不同程度增高或降低,差異顯著(P0.05)。第7d,16MAhfq組血清就能檢測(cè)出抗體,然后持續(xù)上升,第45d達(dá)到最高OD450nm=0.57,攻毒后小鼠血清中抗體再次升高,攻毒后第28d,抗體水平達(dá)到OD450nm=0.79,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與PBS組相比,差異顯著(P0.05)。保護(hù)性評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果說明16M△hfq使宿主產(chǎn)生了特異性免疫反應(yīng),具有良好的免疫保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：布病 hfq 毒力相關(guān)因子 宿主免疫反應(yīng) 免疫保護(hù)作用
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文縮略詞表10-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-31
• 1 布魯氏菌概況14-24
• 1.1 布病的病原學(xué)特征及流行現(xiàn)狀14-15
• 1.2 布魯氏菌致病機(jī)理15-17
• 1.3 布魯氏菌重要毒力相關(guān)因子17-20
• 1.3.1 布魯氏菌外膜蛋白Omp25、Omp3118
• 1.3.2 密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控子VjbR、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GntR18-19
• 1.3.3 應(yīng)激反應(yīng)蛋白DnaK、HtrA19-20
• 1.4 布魯氏菌引起宿主免疫機(jī)制的研究概況20-22
• 1.5 布魯氏菌疫苗概況22-24
• 2 Hfq在細(xì)菌中的研究進(jìn)展24-30
• 2.1 Hfq的結(jié)構(gòu)特征25
• 2.2 Hfq的主要功能25-29
• 2.2.1 Hfq參與細(xì)菌多種生理代謝過程25-26
• 2.2.2 Hfq影響細(xì)菌毒力及分泌系統(tǒng)26-28
• 2.2.3 Hfq調(diào)控細(xì)菌大量基因28-29
• 2.3 Hfq在布魯氏菌中的研究現(xiàn)狀29-30
• 3 本研究的目的與意義30-31
• 第二章 Hfq對(duì)布魯氏菌毒力影響的研究31-44
• 1 試驗(yàn)材料31-34
• 1.1 菌株與質(zhì)粒31
• 1.2 細(xì)胞系與試驗(yàn)動(dòng)物31-32
• 1.3 主要試劑32-33
• 1.4 主要儀器33-34
• 1.5 引物34
• 2 方法34-37
• 2.1 16M、16M△hfq、16M△hfq-C細(xì)胞侵染試驗(yàn)34-35
• 2.2 16M、16M△hfq、16M△hfq-C小鼠毒力試驗(yàn)35
• 2.3 hfq體內(nèi)體外轉(zhuǎn)錄水平35-36
• 2.3.1 總RNA提取35-36
• 2.3.2 Dnasel處理36
• 2.3.3 cDNA合成36
• 2.3.4 PCR擴(kuò)增36
• 2.4 毒力相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平36-37
• 3 結(jié)果37-41
• 3.1 16M、16M△hfq、16M△hfq-C細(xì)胞侵染與小鼠毒力試驗(yàn)37-38
• 3.2 hfq體內(nèi)外轉(zhuǎn)錄水平38
• 3.3 毒力相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平38-41
• 4 討論41-44
• 4.1 Hfq調(diào)控胞內(nèi)生存能力與毒力41-42
• 4.2 Hfq調(diào)控大量毒力相關(guān)因子42-44
• 第三章 羊種布魯氏菌hfq突變株免疫保護(hù)作用研究44-53
• 1 試驗(yàn)材料44-45
• 1.1 菌株與質(zhì)粒44
• 1.2 細(xì)胞系與試驗(yàn)動(dòng)物44
• 1.3 主要試劑44
• 1.4 主要儀器44-45
• 1.5 引物45
• 2 試驗(yàn)方法45-46
• 2.1 小鼠攻毒試驗(yàn)45
• 2.2 細(xì)胞因子水平測(cè)定45-46
• 2.3 血清IgG水平測(cè)定46
• 3 結(jié)果46-51
• 3.1 小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)46-47
• 3.2 細(xì)胞因子水平測(cè)定47-50
• 3.2.1 感染小鼠細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平及分泌水平47-49
• 3.2.2 攻毒小鼠細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平及分泌水平49-50
• 3.3 血清IgG水平測(cè)定50-51
• 4 討論51-53
• 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)53-54
• 1 結(jié)論53
• 2 創(chuàng)新點(diǎn)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-65
• 致謝65-67
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄67-68

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1049015