本文關(guān)鍵詞：eIF4A3對(duì)流感病毒復(fù)制的影響及其作用機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 流感病毒 eIF4A3 PB1 Co-IP 聚合酶活力 RNP組裝 核輸出

【摘要】：流感病毒屬于正粘病毒科的單股負(fù)鏈RNA病毒,基因組分為八個(gè)節(jié)段,其中編碼PA、PB1、PB2和NP蛋白的基因高度保守,且它們與流感病毒vRNA結(jié)合以后形成vRNP,主要負(fù)責(zé)流感病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。流感病毒與宿主細(xì)胞相互作用構(gòu)成了病毒感染、復(fù)制、致病及免疫的分子基礎(chǔ)。因此,理解宿主因子與流感病毒的相互作用不僅有利于我們深入了解流感病毒生活周期,也有利于開發(fā)新的抗流感藥物。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中通過串聯(lián)親和純化實(shí)驗(yàn)篩選到與聚合酶復(fù)合物互作的宿主蛋白eIF4A3(Eukaryotic translation initiation factor 4A isoform 3)。并且本研究證實(shí)該蛋白可以與流感病毒聚合酶亞基PB1相互作用,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠顯著促進(jìn)流感病毒的增殖,促進(jìn)流感病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。探究該蛋白促進(jìn)流感病毒增殖的作用機(jī)制時(shí)我們發(fā)現(xiàn)e IF4A3過表達(dá)時(shí)可以促進(jìn)流感病毒聚合酶活性,而且這種促進(jìn)作用是通過提高聚合酶系統(tǒng)組裝實(shí)現(xiàn)的。同時(shí),e IF4A3干擾時(shí)可以顯著抑制流感病毒vRNP核輸出。這不僅拓展了現(xiàn)有的流感病毒與宿主因子相互作用網(wǎng)絡(luò),也為以后流感的防控提供了新的思路和方向。主要研究結(jié)果如下:1 eIF4A3促進(jìn)流感病毒增殖本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中通過串聯(lián)親和純化實(shí)驗(yàn)篩選到與流感病毒聚合酶復(fù)合物互作的宿主蛋白eIF4A3,通過檢測(cè)eIF4A3干擾之后對(duì)PR8及HM流感病毒mRNA水平的影響,初步確定了eIF4A3干擾之后可以顯著抑制流感病毒復(fù)制。進(jìn)一步通過TCID50實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證eIF4A3對(duì)流感病毒增殖的影響,結(jié)果與上面一致,即e IF4A3干擾之后可以顯著抑制流感病毒的增殖。2流感病毒感染過程中,eIF4A3促進(jìn)流感病毒轉(zhuǎn)錄,復(fù)制在A549細(xì)胞上將e IF4A3干擾和過表達(dá)之后感染HM,并于4h,6h,8h收樣,通過熒光定量方法檢測(cè)eIF4A3對(duì)流感病毒mRNA,cRNA和vRNA水平影響,同時(shí)通過Western檢測(cè)該蛋白對(duì)流感病毒蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果證實(shí)該蛋白在干擾之后可以顯著抑制流感病毒復(fù)制,轉(zhuǎn)錄,過表達(dá)時(shí)能夠顯著促進(jìn)流感病毒轉(zhuǎn)錄,復(fù)制。3 eIF4A3可以和流感病毒聚合酶亞基PB1相互作用通過Co-IP實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)e IF4A3能夠與流感病毒聚合酶亞基PB1發(fā)生相互作用,而與其它亞基不存在相互作用,且在感染情況下eIF4A3與內(nèi)源性PB1也存在相互作用;進(jìn)一步通過激光共聚焦顯微鏡ZEISS檢測(cè)PB1與eIF4A3的亞細(xì)胞定位情況,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)蛋白在空間上存在共定位,主要定位于胞核。4 eIF4A3促進(jìn)流感病毒聚合酶活性用293T細(xì)胞檢測(cè)eIF4A3干擾與過表達(dá)時(shí)對(duì)流感病毒聚合酶活性的影響,發(fā)現(xiàn)該蛋白過表達(dá)可以顯著促進(jìn)流感病毒聚合酶活性,干擾之后可以顯著抑制聚合酶活性。5在聚合酶系統(tǒng)中,eIF4A3可以促進(jìn)流感病毒聚合酶系統(tǒng)組裝探究eIF4A3促進(jìn)流感病毒聚合酶活性的原因,我們首先將eIF4A3過表達(dá)293T細(xì)胞,24小時(shí)后Western檢測(cè)該蛋白對(duì)流感病毒聚合酶各個(gè)亞基及NP蛋白表達(dá)水平的影響,發(fā)現(xiàn)該蛋白對(duì)各個(gè)蛋白表達(dá)均沒有影響,進(jìn)一步通過Co-IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)eIF4A3對(duì)該聚合酶系統(tǒng)組裝的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,eIF4A3可以顯著促進(jìn)流感病毒聚合酶系統(tǒng)RNP組裝。6 eIF4A3干擾之后抑制流感病毒vRNP的核輸出將eIF4A3干擾之后接毒HM,并于5h之后進(jìn)行固定,透化,染色,利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)eIF4A3干擾之后可以顯著抑制NP蛋白的核輸出。7 eIF4A3蛋白解旋酶功能在它對(duì)流感病毒影響中發(fā)揮重要作用為研究eIF4A3蛋白解旋酶功能在它對(duì)流感病毒影響中發(fā)揮的作用,我們將該蛋白DEAD區(qū)域進(jìn)行突變,通過相對(duì)熒光定量方法檢測(cè)該區(qū)域突變后對(duì)流感病毒復(fù)制的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)eIF4A3突變之后,該蛋白對(duì)流感病毒促進(jìn)作用消失,變?yōu)橐种啤?br/> 【關(guān)鍵詞】：流感病毒 eIF4A3 PB1 Co-IP 聚合酶活力 RNP組裝 核輸出
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 縮略語(yǔ)表(Abbreviation)11-13
• 第1章 前言13-21
• 1.1 文獻(xiàn)綜述13-20
• 1.1.1 流感病毒簡(jiǎn)介13
• 1.1.2 流感病毒RNA聚合酶和NP蛋白13-14
• 1.1.3 流感病毒轉(zhuǎn)錄與復(fù)制14-17
• 1.1.4 流感病毒聚合酶與流感致病性和跨種傳播關(guān)系17
• 1.1.5 流感病毒與宿主因子研究17-18
• 1.1.6 eIF4A318-20
• 1.2 研究目的與意義20-21
• 第2章 材料與方法21-32
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 細(xì)菌、細(xì)胞、病毒、質(zhì)粒21
• 2.1.2 抗體21
• 2.1.3 siRNA21
• 2.1.4 主要試劑與培養(yǎng)基21-22
• 2.1.5 主要酶和試劑盒22
• 2.1.6 重要儀器和設(shè)備22-23
• 2.2 主要方法23-32
• 2.2.1 DNA實(shí)驗(yàn)23-26
• 2.2.2 RNA實(shí)驗(yàn)26-27
• 2.2.3 蛋白實(shí)驗(yàn)27-30
• 2.2.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)30-31
• 2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理31-32
• 第3章 結(jié)果與分析32-45
• 3.1 eIF4A3的克隆與表達(dá)32-33
• 3.2 eIF4A3對(duì)流感病毒增殖的影響33-35
• 3.3 eIF4A3對(duì)流感病毒轉(zhuǎn)錄，復(fù)制的影響35-36
• 3.4 eIF4A3對(duì)流感病毒蛋白水平的影響36-37
• 3.5 eIF4A3與聚合酶亞基PB1相互作用37-39
• 3.6 eIF4A3與PB1的共定位情況39-40
• 3.7 eIF4A3促進(jìn)流感病毒聚合酶活性40-41
• 3.8 eIF4A3促進(jìn)流感病毒聚合酶組裝41-43
• 3.9 eIF4A3促進(jìn)流感病毒NP的核輸出43
• 3.10 eIF4A3功能突變體對(duì)流感病毒增殖的影響43-45
• 第4章 討論45-47
• 第5章 小結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-58
• 致謝58

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