本文關(guān)鍵詞：eIF4A3對流感病毒復制的影響及其作用機制研究

  更多相關(guān)文章： 流感病毒 eIF4A3 PB1 Co-IP 聚合酶活力 RNP組裝 核輸出

【摘要】：流感病毒屬于正粘病毒科的單股負鏈RNA病毒,基因組分為八個節(jié)段,其中編碼PA、PB1、PB2和NP蛋白的基因高度保守,且它們與流感病毒vRNA結(jié)合以后形成vRNP,主要負責流感病毒的轉(zhuǎn)錄與復制。流感病毒與宿主細胞相互作用構(gòu)成了病毒感染、復制、致病及免疫的分子基礎(chǔ)。因此,理解宿主因子與流感病毒的相互作用不僅有利于我們深入了解流感病毒生活周期,也有利于開發(fā)新的抗流感藥物。本實驗室在前期的研究中通過串聯(lián)親和純化實驗篩選到與聚合酶復合物互作的宿主蛋白eIF4A3(Eukaryotic translation initiation factor 4A isoform 3)。并且本研究證實該蛋白可以與流感病毒聚合酶亞基PB1相互作用,進一步發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠顯著促進流感病毒的增殖,促進流感病毒的轉(zhuǎn)錄與復制。探究該蛋白促進流感病毒增殖的作用機制時我們發(fā)現(xiàn)e IF4A3過表達時可以促進流感病毒聚合酶活性,而且這種促進作用是通過提高聚合酶系統(tǒng)組裝實現(xiàn)的。同時,e IF4A3干擾時可以顯著抑制流感病毒vRNP核輸出。這不僅拓展了現(xiàn)有的流感病毒與宿主因子相互作用網(wǎng)絡(luò),也為以后流感的防控提供了新的思路和方向。主要研究結(jié)果如下:1 eIF4A3促進流感病毒增殖本實驗室在前期的研究中通過串聯(lián)親和純化實驗篩選到與流感病毒聚合酶復合物互作的宿主蛋白eIF4A3,通過檢測eIF4A3干擾之后對PR8及HM流感病毒mRNA水平的影響,初步確定了eIF4A3干擾之后可以顯著抑制流感病毒復制。進一步通過TCID50實驗驗證eIF4A3對流感病毒增殖的影響,結(jié)果與上面一致,即e IF4A3干擾之后可以顯著抑制流感病毒的增殖。2流感病毒感染過程中,eIF4A3促進流感病毒轉(zhuǎn)錄,復制在A549細胞上將e IF4A3干擾和過表達之后感染HM,并于4h,6h,8h收樣,通過熒光定量方法檢測eIF4A3對流感病毒mRNA,cRNA和vRNA水平影響,同時通過Western檢測該蛋白對流感病毒蛋白表達的影響。結(jié)果證實該蛋白在干擾之后可以顯著抑制流感病毒復制,轉(zhuǎn)錄,過表達時能夠顯著促進流感病毒轉(zhuǎn)錄,復制。3 eIF4A3可以和流感病毒聚合酶亞基PB1相互作用通過Co-IP實驗我們發(fā)現(xiàn)e IF4A3能夠與流感病毒聚合酶亞基PB1發(fā)生相互作用,而與其它亞基不存在相互作用,且在感染情況下eIF4A3與內(nèi)源性PB1也存在相互作用;進一步通過激光共聚焦顯微鏡ZEISS檢測PB1與eIF4A3的亞細胞定位情況,發(fā)現(xiàn)兩個蛋白在空間上存在共定位,主要定位于胞核。4 eIF4A3促進流感病毒聚合酶活性用293T細胞檢測eIF4A3干擾與過表達時對流感病毒聚合酶活性的影響,發(fā)現(xiàn)該蛋白過表達可以顯著促進流感病毒聚合酶活性,干擾之后可以顯著抑制聚合酶活性。5在聚合酶系統(tǒng)中,eIF4A3可以促進流感病毒聚合酶系統(tǒng)組裝探究eIF4A3促進流感病毒聚合酶活性的原因,我們首先將eIF4A3過表達293T細胞,24小時后Western檢測該蛋白對流感病毒聚合酶各個亞基及NP蛋白表達水平的影響,發(fā)現(xiàn)該蛋白對各個蛋白表達均沒有影響,進一步通過Co-IP實驗檢測eIF4A3對該聚合酶系統(tǒng)組裝的影響時發(fā)現(xiàn),與對照相比,eIF4A3可以顯著促進流感病毒聚合酶系統(tǒng)RNP組裝。6 eIF4A3干擾之后抑制流感病毒vRNP的核輸出將eIF4A3干擾之后接毒HM,并于5h之后進行固定,透化,染色,利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)eIF4A3干擾之后可以顯著抑制NP蛋白的核輸出。7 eIF4A3蛋白解旋酶功能在它對流感病毒影響中發(fā)揮重要作用為研究eIF4A3蛋白解旋酶功能在它對流感病毒影響中發(fā)揮的作用,我們將該蛋白DEAD區(qū)域進行突變,通過相對熒光定量方法檢測該區(qū)域突變后對流感病毒復制的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)eIF4A3突變之后,該蛋白對流感病毒促進作用消失,變?yōu)橐种啤?br/> 【關(guān)鍵詞】：流感病毒 eIF4A3 PB1 Co-IP 聚合酶活力 RNP組裝 核輸出
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 縮略語表(Abbreviation)11-13
• 第1章 前言13-21
• 1.1 文獻綜述13-20
• 1.1.1 流感病毒簡介13
• 1.1.2 流感病毒RNA聚合酶和NP蛋白13-14
• 1.1.3 流感病毒轉(zhuǎn)錄與復制14-17
• 1.1.4 流感病毒聚合酶與流感致病性和跨種傳播關(guān)系17
• 1.1.5 流感病毒與宿主因子研究17-18
• 1.1.6 eIF4A318-20
• 1.2 研究目的與意義20-21
• 第2章 材料與方法21-32
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 細菌、細胞、病毒、質(zhì)粒21
• 2.1.2 抗體21
• 2.1.3 siRNA21
• 2.1.4 主要試劑與培養(yǎng)基21-22
• 2.1.5 主要酶和試劑盒22
• 2.1.6 重要儀器和設(shè)備22-23
• 2.2 主要方法23-32
• 2.2.1 DNA實驗23-26
• 2.2.2 RNA實驗26-27
• 2.2.3 蛋白實驗27-30
• 2.2.4 細胞實驗30-31
• 2.2.5 統(tǒng)計學處理31-32
• 第3章 結(jié)果與分析32-45
• 3.1 eIF4A3的克隆與表達32-33
• 3.2 eIF4A3對流感病毒增殖的影響33-35
• 3.3 eIF4A3對流感病毒轉(zhuǎn)錄，復制的影響35-36
• 3.4 eIF4A3對流感病毒蛋白水平的影響36-37
• 3.5 eIF4A3與聚合酶亞基PB1相互作用37-39
• 3.6 eIF4A3與PB1的共定位情況39-40
• 3.7 eIF4A3促進流感病毒聚合酶活性40-41
• 3.8 eIF4A3促進流感病毒聚合酶組裝41-43
• 3.9 eIF4A3促進流感病毒NP的核輸出43
• 3.10 eIF4A3功能突變體對流感病毒增殖的影響43-45
• 第4章 討論45-47
• 第5章 小結(jié)47-48
• 參考文獻48-58
• 致謝58

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