本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌黏附素EtpA酵母工程菌對腸道菌群和黏膜免疫的影響

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【摘要】：產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)屬于致病性大腸桿菌的一種,常因食物及水源的污染而引發(fā)人和動物的感染,特別是在初生動物中有很高的發(fā)病率、死亡率,制約了養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展,同時威脅了人類的健康。研究發(fā)現(xiàn),其主要致病因子是腸毒素和黏附素。Etp A屬于黏附素中的一種,分子量較大,能與腸上皮細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合,在細(xì)菌和腸壁之間形成分子橋,介導(dǎo)ETEC的黏附。EtpA在不同血清型的ETEC中表達(dá)高度保守,同源性很高。另有實驗證實,Etp A具有良好的免疫原性,能夠有效阻止ETEC對腸道上皮細(xì)胞的黏附。這一發(fā)現(xiàn)為預(yù)防ETEC引起的動物腹瀉,開拓了新的思路。為了降低由ETEC造成的經(jīng)濟(jì)損失,減弱ETEC對動物健康的損害,在尋找有效的預(yù)防辦法的同時,提高動物的免疫功能也至關(guān)重要。動物腸道面積巨大,其中聚居著數(shù)量龐大的微生物菌群稱為腸道菌群;腸道黏膜還擁有豐富的免疫細(xì)胞及免疫分子,參與構(gòu)成機(jī)體抵御病原微生物侵入的腸道黏膜免疫系統(tǒng)。其中有益菌群的增加能調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,豐富菌群多態(tài)性,促進(jìn)腸道黏膜生長,刺激腸黏膜分泌免疫分子,提高腸道黏膜免疫功能,幫助機(jī)體抵御病原微生物的侵襲。釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)是酵母菌科(Saccharomycetaceae),酵母菌屬(Saccharomycodes)的成員,屬于益生菌的一種。在研究其益生作用時發(fā)現(xiàn),它含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和未知生長因子,能提高動物的生產(chǎn)性能,促進(jìn)腸道黏膜發(fā)育,增加有益菌群的數(shù)量,增強(qiáng)腸道黏膜免疫功能。本課題組通過基因克隆、同源重組等技術(shù),使大腸桿菌黏附素Etp A在釀酒酵母菌中高效表達(dá),成功構(gòu)建出Etp A酵母工程菌。并在細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn),Etp A酵母工程菌能有效阻止ETEC對腸上皮細(xì)胞的黏附,具有保護(hù)上皮細(xì)胞的作用。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了以下實驗:1.本研究選取斷奶日齡21d的SPF級健康SD大鼠120只,雌雄各半。隨機(jī)分為3組:空白對照組、釀酒酵母菌組(以下簡稱為釀酒酵母組)、Etp A酵母工程菌組(以下簡稱為Etp A組),每組40只,雌雄各半。實驗期間分別給3組大鼠灌服生理鹽水、107 CFU/mL釀酒酵母菌菌液、107 CFU/mL Etp A酵母工程菌菌液,每天1次,每次2mL/只,共持續(xù)28d;然后連續(xù)3d灌服108 CFU/mL大腸桿菌(H10407)菌液,每天1次,每次5mL/只。分別于實驗第7、14、21、28d和結(jié)束灌服大腸桿菌菌液3d后,取各組大鼠糞便。通過末端限制性片段長度多態(tài)性(t-rflp)、實時熒光定量pcr、ph值檢測技術(shù),研究了etpa酵母工程菌對腸道菌群otu(微生物可操作單元)和ph值的影響,以及對腸道重要菌群:類桿菌(bacteriodes)、梭菌(clostridium)、腸球菌(enterococcus)、雙歧桿菌(bifidobacterium)、乳桿菌(lactobacillaceae)數(shù)量的影響。2.本研究分別于實驗第7、14、21、28d和結(jié)束灌服大腸桿菌菌液3d后,采集大鼠十二指腸、空腸、回腸組織。通過組織切片觀察、酶聯(lián)免疫吸附實驗(elisa)、實時熒光定量pcr技術(shù)研究了etpa酵母工程菌對十二指腸、空腸、回腸絨毛長度、寬度、腸隱窩深度、絨毛長度/隱窩深度(v/c)的影響;對腸道黏膜中重要免疫分子:分泌型免疫球蛋白a(siga)、白介素-2(il-2)、白介素-4(il-4)及干擾素-γ(ifn-γ)分泌量的影響。實驗結(jié)果如下:1.etpa酵母工程菌對腸道菌群的影響:(1)etpa酵母工程菌對腸道菌群多態(tài)性的影響:釀酒酵母組和etpa組的otu值在7、14、21、28d均高于空白對照組,并在第14d達(dá)到最大值,均與空白對照組差異極顯著(p0.01),但釀酒酵母組和etpa組間無顯著差異(p0.05)。灌服etec后,etpa組與灌服前無明顯差異(p0.05),且顯著高于釀酒酵母組(p0.05),極顯著高于空白對照組(p0.01)。(2)etpa酵母工程菌對腸道重要菌群的影響:釀酒酵母組和etpa組的重要菌群數(shù)量在7~28d均高于空白對照組。(1)釀酒酵母組和etpa組的類桿菌數(shù)量在第21d、28d顯著高于空白對照組(p0.05),釀酒酵母組和etpa組間無顯著差異(p0.05)。灌服etec后,etpa組與灌服前無明顯差異(p0.05),且極顯著高于釀酒酵母組和空白對照組(p0.01)。(2)釀酒酵母組和etpa組的梭菌數(shù)量在第14d增長量最大,且14d、28d時,均極顯著高于空白對照組(p0.01),釀酒酵母組和etpa組間無顯著差異(p0.05)。灌服etec后,僅有空白對照組顯著高于灌服前(p0.05),與釀酒酵母組、etpa組均無顯著差異(p0.05)。(3)釀酒酵母組和etpa組的腸球菌數(shù)量在第14d出現(xiàn)顯著增長,于第21d,極顯著高于空白對照組(p0.01),釀酒酵母組和etpa組間無顯著差異(p0.05)。灌服etec后,etpa組與灌服前無明顯差異(p0.05),空白對照組、釀酒酵母組均顯著高于灌服前(p0.05),各組之間無顯著差異(p0.05)。(4)釀酒酵母組和etpa組的雙歧桿菌數(shù)量從第7d起明顯增高,于第14d,極顯著高于空白對照組(p0.01),釀酒酵母組和etpa組間無顯著差異(p0.05)。灌服etec后,etpa組與灌服前無明顯差異(p0.05),顯著高于釀酒酵母組(p0.05),極顯著高于空白對照組(p0.01)。(5)釀酒酵母組和etpa組的乳桿菌數(shù)量在第14d、21d,極顯著高于空白對照組(p0.01),釀酒酵母組和etpa組間無顯著差異(p0.05)。灌服etec后,各組均出現(xiàn)下降,etpa組極顯著高于空白對照組和釀酒酵母菌組(p0.01)。(3)etpa酵母工程菌對腸道菌群ph的影響:實驗第7~28d,釀酒酵母組和etpa組的ph值呈下降趨勢,在第21d,均顯著低于空白對照組(p0.05),釀酒酵母組和etpa組間無顯著差異(p0.05)。灌服etec后,空白對照組ph值顯著升高(p0.05),極顯著高于釀酒酵母組和etpa組,釀酒酵母組和etpa組間差異顯著(p0.05)。2.etpa酵母工程菌對腸道黏膜免疫的影響:(1)etpa酵母工程菌對腸道黏膜結(jié)構(gòu)的影響:(1)釀酒酵母組和etpa組的小腸各段絨毛長度在7~28d均呈增長趨勢,均于第28d達(dá)到最大值,其中空腸絨毛長度極顯著高于空白對照組(p0.01),釀酒酵母組和etpa組間無顯著差異(p0.05)。灌服etec后,空白對照組和釀酒酵母組的空腸絨毛長度極顯著下降(p0.01),與etpa組差異極顯著(p0.01)。(2)釀酒酵母組和etpa組的小腸各段絨毛寬度在實驗中均無顯著差異(p0.05)。(3)釀酒酵母組和etpa組的空腸隱窩深度在第28d,顯著低于空白對照組(p0.05),釀酒酵母組和etpa組間無顯著差異(p0.05)。灌服etec后,各組的空腸隱窩深度極顯著升高(p0.01),etpa組極顯著低于空白對照組和釀酒酵母組(p0.01)。(4)釀酒酵母組和etpa組空腸、回腸v/c值均在28d達(dá)到最大最,且在第28d時空腸v/c值極顯著高于空白對照組(p0.01),釀酒酵母組和etpa組間無顯著差異(p0.05)。灌服etec后,空白對照組空腸v/c值極顯著下降(p0.01),且極顯著低于釀酒酵母組和etpa組(p0.01);釀酒酵母組回腸v/c值顯著下降(p0.05),且顯著低于etpa組(p0.05)。(2)etpa酵母工程菌對腸道黏膜中siga的影響:實驗第7~28d,釀酒酵母組和etpa組的siga含量呈上升趨勢,于第21d達(dá)到最大值,均極顯著高于空白對照組(p0.01),釀酒酵母組和etpa組間無顯著差異(p0.05)。灌服etec后,各組均極顯著下降(p0.01),etpa組極顯著高于空白對照組和釀酒酵母菌組(p0.01)。(3)etpa酵母工程菌對腸道黏膜中重要細(xì)胞因子的影響:實驗第7~28d,釀酒酵母組和etpa組的il-2、il-4、ifn-γ呈上升趨勢,在第14d,il-2的相對增長倍數(shù)最大,與空白對照組差異極顯著(p0.01);從第14d起il-4、ifn-γ快速增長,在第21d、28d,均極顯著高于空白對照組(p0.01),釀酒酵母組和etpa組間無顯著差異(p0.05)。灌服etec后,空白對照組和釀酒酵母菌組的il-2、il-4、ifn-γ均極顯著變化(p0.01),il-2、il-4的含量極顯著低于etpa組(P0.01),IFN-γ的含量極顯著高于EtpA組(P0.01)。綜合以上結(jié)果得到以下結(jié)論:1.Etp A酵母工程菌具有釀酒酵母的益生作用:能有效促進(jìn)小腸黏膜的發(fā)育,加強(qiáng)腸道黏膜的吸收功能;豐富腸道菌群多態(tài)性,增加重要菌群數(shù)量;降低腸道菌群pH值;刺激腸道黏膜中重要免疫分子的分泌,加強(qiáng)腸道黏膜免疫功能。2.從灌服第7d起隨著灌服天數(shù)的增加,小腸各段絨毛長度、V/C值逐漸增加;腸道內(nèi)有益菌群及重要細(xì)胞因子在第14d大幅度增加,而后緩慢增加;SIgA在第21d分泌量極顯著增加,至第28d達(dá)到最高。3.Etp A酵母工程菌發(fā)揮了大腸桿菌黏附素Etp A的免疫原性:當(dāng)ETEC侵入機(jī)體時,能有效阻止ETEC的黏附,保護(hù)腸道黏膜結(jié)構(gòu)的完整,維護(hù)腸道菌群的穩(wěn)定,提高腸道黏膜免疫能力。
【關(guān)鍵詞】：EtpA酵母工程菌 腸道菌群 腸道黏膜免疫
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 前言14-16
• 第一章 Etp A酵母工程菌對腸道菌群的影響16-37
• 1 材料與方法16-22
• 1.1 材料16-18
• 1.2 方法18-22
• 2 結(jié)果22-33
• 2.1 Etp A酵母工程菌對腸道菌群多態(tài)性的影響22-26
• 2.2 Etp A酵母工程菌對腸道重要菌群的影響26-32
• 2.3 Etp A酵母工程菌對腸道菌群p H的影響32-33
• 3 討論33-36
• 3.1 Etp A酵母工程菌對腸道菌群多態(tài)性的影響33
• 3.2 Etp A酵母工程菌對腸道重要菌群的影響33-35
• 3.3 Etp A酵母工程菌對腸道菌群p H的影響35-36
• 4 小結(jié)36-37
• 第二章 Etp A酵母工程菌對腸道黏膜免疫的影響37-60
• 1 材料與方法37-41
• 1.1 材料37-38
• 1.2 方法38-41
• 2 結(jié)果41-56
• 2.1 Etp A酵母工程菌對腸道黏膜結(jié)構(gòu)的影響41-52
• 2.2 Etp A酵母工程菌對腸道黏膜中SIg A的影響52-53
• 2.3 Etp A酵母工程菌對腸道黏膜中重要細(xì)胞因子的影響53-56
• 3 討論56-59
• 3.1 Etp A酵母工程菌對腸道黏膜結(jié)構(gòu)的影響56-57
• 3.2 Etp A酵母工程菌對腸道黏膜中SIg A的影響57-58
• 3.3 Etp A酵母工程菌對腸道黏膜中重要細(xì)胞因子的影響58-59
• 4 小結(jié)59-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-66
• 個人簡歷66-67
• 致謝67

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本文編號：1028315