本文關(guān)鍵詞：貓杯狀病毒的分離鑒定及其細(xì)胞傳代

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【摘要】：貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)是杯狀病毒科的成員,是引起貓科動物疾病的一種重要病原體。貓感染FCV后,出現(xiàn)發(fā)熱、口腔潰瘍、鼻-結(jié)膜炎等臨床癥狀,發(fā)病嚴(yán)重時會導(dǎo)致死亡。貓杯狀病毒流行廣泛,在世界多個國家均有流行。我國從貓、老虎、獵豹等多種動物體內(nèi)分離到FCV。不同貓杯狀病毒毒株間變異程度較大,抗原性有差異,現(xiàn)有疫苗并不能提供完全的保護效果。目前,貓杯狀病毒疫苗主要為弱毒疫苗和滅活疫苗,隨著FCV的廣泛流行,不斷出現(xiàn)新的變異毒株。因此,開展對FCV的相關(guān)研究對其防控具有重要的意義。本研究對采自吉林地區(qū)疑似貓傳染性鼻結(jié)膜炎患貓鼻咽拭子進(jìn)行處理后,在F81細(xì)胞上進(jìn)行分離培養(yǎng),開展分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)等系統(tǒng)鑒定;將分離病毒及實驗室保存的1株豹源貓杯狀病毒在F81細(xì)胞上連續(xù)傳至20代。每次細(xì)胞傳代前,測定病毒的半數(shù)感染量(TCID50),然后以0.1MOI的感染復(fù)數(shù)接種F81細(xì)胞,記錄病變時間,并繪制病毒的生長曲線;采用RT-PCR方法擴增FCV各代次(P1、P5、P10、P15、P20)的ORF2基因片段,進(jìn)行基因序列的測定;利用DNASTAR、MEGA等軟件將測序結(jié)果與Genbank上收錄的FCV參考序列進(jìn)行比對,分析其氨基酸變異位點,并繪制遺傳進(jìn)化樹;應(yīng)用Net NGlyc1.0、Yin OYang1.2、Prot Scale等在線軟件預(yù)測ORF2基因編碼蛋白的糖基化位點和疏水性。實驗結(jié)果顯示,貓鼻咽拭子接種F81細(xì)胞后,出現(xiàn)葡萄串樣典型病變,經(jīng)過分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)鑒定,證實所分離毒株為貓杯狀病毒,分別命名為CH-JL1株、CH-JL2株、CH-JL3株和CH-JL4株;細(xì)胞傳代后,5株FCV滴度逐漸穩(wěn)定,最終達(dá)到109.0TCID50/mL以上;生長曲線測定結(jié)果表明,FCV各毒株在細(xì)胞上的復(fù)制特點有差異,CH-JL3株和CH-SH株在16h左右達(dá)到最高的病毒滴度,CH-JL2株和CH-JL4株均在20h左右病毒滴度最高,而CH-JL1株病毒的滴度高峰在24h之后;ORF2基因序列比對分析結(jié)果表明,FCV細(xì)胞傳代后的氨基酸變異位點包括CH-JL1株的P57S和G494R、CH-JL3株的S440L和N519D、CH-JL4株的V614I、CH-SH株的K448R;遺傳進(jìn)化分析表明CH-JL2株和CH-JL3株處于同一進(jìn)化分支上,同源性為95.9%;CH-JL1株和國內(nèi)FB-NJ-13株、CH-SH株和國內(nèi)GD株分別在一個進(jìn)化分支,CH-JL4株和國外F65株遺傳關(guān)系較近。ORF2基因編碼蛋白的糖基化位點和疏水性預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)5株FCV疏水性相似,均存在多個O-糖基化位點。本研究從貓鼻咽拭子中成功分離出貓杯狀病毒,通過細(xì)胞連續(xù)傳代,獲得了滴度高、穩(wěn)定性好的貓杯狀病毒株,為下一步FCV疫苗株的研發(fā)打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：貓杯狀病毒 細(xì)胞傳代 F81細(xì)胞 基因變異
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-10
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述10-18
• 1.1 貓杯狀病毒的概述10-13
• 1.2 貓杯狀病毒的流行病學(xué)13-14
• 1.3 貓杯狀病毒感染的診斷14
• 1.4 貓杯狀病毒感染的防控14-15
• 1.5 病毒的分離與鑒定研究進(jìn)展15-16
• 1.6 研究目的和意義16-18
• 第二篇 研究內(nèi)容18-45
• 第一章 貓杯狀病毒的分離和鑒定18-29
• 1.1 材料18-20
• 1.2 方法20-24
• 1.3 結(jié)果24-27
• 1.4 討論27-28
• 1.5 小結(jié)28-29
• 第二章 貓杯狀病毒的細(xì)胞傳代及ORF2基因變異分析29-45
• 2.1 材料29-31
• 2.2 方法31-34
• 2.3 結(jié)果34-41
• 2.4 討論41-43
• 2.5 小結(jié)43-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-53
• 附錄53-62
• 作者簡介62-63
• 致謝63

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：1025314