本文關(guān)鍵詞：L-抗壞血酸對小鼠卵母細胞和胚胎發(fā)育的作用及其機制研究

  更多相關(guān)文章： L-Ascorbic acid 小鼠卵母細胞 胚胎發(fā)育 DNA甲基化 表觀遺傳

【摘要】：獲取高質(zhì)量成熟的卵母細胞和胚胎是進行人工輔助生殖和動物生產(chǎn)的關(guān)鍵。相對于體內(nèi)自然發(fā)育的條件,體外培養(yǎng)條件會導致卵母細胞和胚胎在成熟和發(fā)育過程中出現(xiàn)異常的表觀遺傳修飾,從而會導致卵母細胞和胚胎發(fā)育率以及發(fā)育質(zhì)量的下降,嚴重的甚至會引起卵母細胞和胚胎的死亡；維生素C是人類必需的營養(yǎng)物質(zhì),最近的研究發(fā)現(xiàn)它能廣泛地影響表觀遺傳修飾,并且可以提高胚胎的發(fā)育率。然而,維生素C在卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程中的作用及其影響胚胎發(fā)育的機理仍有待研究。例如：維生素C能否影響小鼠卵母細胞的發(fā)育率、提高小鼠卵母細胞和胚胎的發(fā)育質(zhì)量、改善因體外培養(yǎng)條件而帶來的異常的表觀遺傳修飾等。本實驗利用卵母細胞和胚胎體外細胞培養(yǎng)、細胞免疫熒光、Western blot、實時熒光定量PCR等技術(shù),檢測了維生素C對于小鼠卵母細胞和胚胎體外培養(yǎng)發(fā)育的影響,探討了L-Ascorbic acid對小鼠卵母細胞和胚胎體外培養(yǎng)最佳的處理濃度。主要實驗結(jié)果如下：1.不同濃度的L-Ascorbic acid處理小鼠卵母細胞后,導致GVBD率都出現(xiàn)了下降；50ug/ml處理組顯著提高了第一極體排放率(P0.05)：100uf/ml處理組顯著降低了第一極體排放率(P0.05)；200ug/ml和1000ug/ml顯著降低了GVBD率(P0.05)；2.免疫熒光結(jié)果顯示：100ug/mlL-Ascorbic acid處理卵母細胞,導致了染色體排列出現(xiàn)異常,排列較為松散：200ug/ml和1000ug/mlL-Ascorbic acid處理卵母細胞后,染色體排列出現(xiàn)了明顯的異常,紡錘體組裝也出現(xiàn)了異常；3.不同濃度的L-Ascorbic acid處理小鼠卵母細胞后,各個處理組甲基化蛋白DNMT1表達量均出現(xiàn)上升；100ug/ml處理濃度開始差異性顯著(P0.05)；小鼠卵母細胞5-mc免疫熒光結(jié)果圖顯示,200ug/ml和1000ug/ml處理均能顯著提高卵母細胞5-mc水平(P0.05)；4.體內(nèi)成熟卵母細胞紡錘體檢驗點蛋白BubRl低于體外培養(yǎng)的小鼠卵母細胞；50 ug/ml處理顯著性的降低體外培養(yǎng)卵母細胞BubRl蛋白的表達量,接近于體內(nèi)BubR1蛋白的表達量；100 ug/ml處理組和1000ug/ml處理組著地降低了體外培養(yǎng)卵母細胞紡錘體檢驗點相關(guān)蛋白BubRl蛋白的表達量(P0.01)；5.不同濃度的L-Ascorbic acid處理對體外培養(yǎng)卵母細胞通路蛋白P-ERK表達量的影響：50ug/mlL-Ascorbic acid處理組降低了P-ERK表達量；100ug/ml處理濃度開始,P-ERK蛋白的表達量顯著的上升(P0.05)；6. RT-PCR結(jié)果顯示小鼠卵母細胞中主要起作用的去甲基化基因是TET3,不同濃度的L-Ascorbic acid處理小鼠卵母細胞后,甲基化基因DNMT1和去甲基化基因TET3的mRNA水平均上升；全能性基因Kif4的mRNA水平均下降； 100ug/ml處理后OCT4mRNA水平高于對照組,但差異性不顯著；其他處理組mRNA水平均下降；7.2cell時期體內(nèi)胚胎5-mc水平高于體外培養(yǎng)胚胎,5-hmc水平體內(nèi)胚胎顯著高于體外培養(yǎng)胚胎(P0.05)；8cel1、Morula、Blastula時期體外培養(yǎng)胚胎5-mc水平顯著高于體內(nèi)胚胎(P0.01)；8cel1、Blastula時期體外培養(yǎng)胚胎5-hmc水平顯著高于體內(nèi)胚胎(P0.01),Morula時期體外培養(yǎng)胚胎5-hmc水平高于體內(nèi)胚胎,差異不顯著；8.Morula時期,體內(nèi)胚胎去甲基化基因TET2 mRNA水平要顯著高于體外培養(yǎng)胚胎(P0.05)；TET3主要在2ce11時期起作用,體內(nèi)胚胎TET3 mRNA的水平顯著高于體外培養(yǎng)胚胎(P0.05)；9.50ug/ml濃度L-Ascorbic acid可以顯著提高2ce11、8ce11(P0.05)；Morula、 Blastula(P0.01)時期的胚胎發(fā)育率。
【關(guān)鍵詞】：L-Ascorbic acid 小鼠卵母細胞 胚胎發(fā)育 DNA甲基化 表觀遺傳
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S814
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮略詞表(Abbreviation)11-12
• 1 前言12-25
• 1.1 表觀遺傳調(diào)控概述13-16
• 1.1.1 DNA甲基化和去甲基化13-14
• 1.1.2 組蛋白乙�；�14-15
• 1.1.3 X染色體失活15-16
• 1.2 小鼠卵母細胞減數(shù)分裂概述16-20
• 1.2.1 小鼠卵母細胞減數(shù)分裂16-17
• 1.2.2 調(diào)控卵母細胞減數(shù)分裂的蛋白因子17-20
• 1.3 維生素C的研究概況20-24
• 1.3.1 維生素C的簡介20-21
• 1.3.2 維生素C的生理功能21
• 1.3.3 維生素C與表觀遺傳調(diào)控的研究進展21-23
• 1.3.4 維生素C應用前景與展望23-24
• 1.4 研究的目的與意義24-25
• 2 材料和方法25-39
• 2.1 實驗技術(shù)路線圖25
• 2.2 實驗材料25-30
• 2.2.1 實驗動物25-26
• 2.2.2 主要儀器設(shè)備26-27
• 2.2.3 實驗試劑藥品27
• 2.2.4 主要試劑配制27-29
• 2.2.5 RT-PCR引物29-30
• 2.3 試驗方法30-38
• 2.3.1 小鼠卵母細胞收集及培養(yǎng)30-31
• 2.3.2 小鼠胚胎獲取與培養(yǎng)31-32
• 2.3.3 小鼠卵母細胞和胚胎5-mc、5-hmc免疫熒光32-34
• 2.3.4 卵母細胞總cDNA的獲取34-35
• 2.3.5 RT-PCR檢測35-37
• 2.3.6 WB檢測卵母細胞相關(guān)蛋白表達37-38
• 2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計38-39
• 3 結(jié)果與分析39-52
• 3.1 L-Ascorbic acid對小鼠卵母細胞體外發(fā)育的影響39-40
• 3.2 L-Ascorbic acid對小鼠卵母細胞染色體動態(tài)和微管蛋白的影響40-41
• 3.3 L-Ascorbic acid對小鼠卵母細胞DNA甲基化水平的影響41-43
• 3.3.1 L-Ascorbic acid對小鼠卵母細胞DNA甲基化相關(guān)蛋白的影響41-42
• 3.3.2 L-Ascorbic acid對小鼠卵母細胞5-me免疫熒光檢測42-43
• 3.4 L-Ascorbic acid對小鼠卵母細胞紡錘體檢驗點相關(guān)蛋白的影響43-44
• 3.5 L-Ascorbic acid對小鼠卵母細胞信號通路相關(guān)蛋白P-ERK的影響44-45
• 3.6 RT-PCR檢測L-Ascorbic acid處理小鼠卵母細胞相關(guān)基因mRNA水平表達45-46
• 3.6.1 去甲基化相關(guān)基因TET家族和DNMT1mRNA水平表達45-46
• 3.6.2 L-Ascorbic acid處理小鼠卵母細全能性基因mRNA水平表達46
• 3.7 體內(nèi)胚胎和體外胚胎5-me和5-hmc差異性比較46-49
• 3.7.1 體外培養(yǎng)胚胎和體內(nèi)胚胎5-mc差異性比較47-48
• 3.7.2 體外培養(yǎng)胚胎和體內(nèi)胚胎5-hmc差異性比較48-49
• 3.8 RT-PCR檢測胚胎去甲基化基因mRNA的表達49
• 3.9 L-Ascorbic acid對小鼠胚胎發(fā)育率的影響49-52
• 4 討論52-59
• 4.1 L-Ascorbic Acid影響小鼠卵母細胞體外發(fā)育相關(guān)機理的探討52-58
• 4.1.1 體外培養(yǎng)條件對卵母細胞發(fā)育成熟的影響52-54
• 4.1.2 L-Ascorbic Acid對小鼠卵母細胞發(fā)育率、染色體及紡錘體動態(tài)的影響54-55
• 4.1.3 L-Ascorbic Acid對小鼠卵母細胞DNA甲基化影響機理的探討55-56
• 4.1.4 L-Ascorbic Acid對小鼠卵母細胞紡錘體檢驗點和信號通路機理影響的探討56-57
• 4.1.5 小結(jié)57-58
• 4.2 L-Ascorbic Acid影響小鼠胚胎體外發(fā)育相關(guān)機理的探討58-59
• 5 小結(jié)59-61
• 5.1 主要結(jié)論59-60
• 5.2 本研究的創(chuàng)新點60
• 5.3 需要進一步研究的相關(guān)問題60-61
• 參考文獻61-72
• 致謝72

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本文編號：1024293