本文關(guān)鍵詞：禽致病性大腸桿菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)2核心組分VgrG致病作用及調(diào)控研究

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【摘要】：禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(Avian Pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的以氣囊炎、關(guān)節(jié)滑膜炎、輸卵管炎和腹膜炎為主要特征的傳染病。禽致病性大腸桿菌常與其它病原混合感染或繼發(fā)感染,從而加重病情,對養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。分泌系統(tǒng)可將細菌蛋白轉(zhuǎn)運到細菌表面,或釋放至細菌外環(huán)境中,或直接注入宿主細胞內(nèi),與細菌的生存及致病性密切相關(guān)。ⅥⅥ型分泌系統(tǒng)(Type VI secretion system, T6SS)的裝置和噬菌體的結(jié)構(gòu)很相似,存在于超過1/4的細菌中。研究表明,T6SS在不同細菌中發(fā)揮不同作用,包括促進細菌毒力、抑制細菌的復(fù)制及調(diào)節(jié)菌間關(guān)系等。在很多致病性大腸桿菌中存在完整的T6SS編碼基因簇,目前在APEC中發(fā)現(xiàn)3個T6SS基因簇,分別為T6SS1、T6SS2、T6SS3。然而,APEC中T6SS核心組分的功能研究甚少,具體作用尚不清楚。研究表明,外界環(huán)境的特定信號能夠調(diào)控T6SS的表達,例如攝鐵調(diào)節(jié)蛋白是細菌鐵依賴基因表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,其可以直接調(diào)控某些條件性病原菌T6SS的表達,如EAEC和愛德華菌。另外,雙組分系統(tǒng)也可調(diào)控T6SS的表達及功能,如沙門菌與銅綠假單胞菌SsrB雙組分系統(tǒng)負調(diào)控T6SS,因此在細菌感染后期才能檢測到T6SS的分泌蛋白。T6SS作為新近發(fā)現(xiàn)的蛋白分泌系統(tǒng),VgrG作為T6SS核心組分,即是結(jié)構(gòu)蛋白又是分泌蛋白,對T6SS的結(jié)構(gòu)及功能至關(guān)重要。本研究克隆表達T6SS核心組分VgrG、分析vgrG基因缺失株的生物學特性、雙組分系統(tǒng)cpxR基因缺失株的生物學特性及對T6SS表達水平的影響,為進一步研究APEC致病作用奠定基礎(chǔ)。1.禽致病性大腸桿菌T6SS2核心組分VgrG克隆表達根據(jù)APEC DE719 T6SS2毒力島vgrG基因序列,設(shè)計合成克隆表達引物,以APEC DE719菌株基因組為模板,擴增vgrG基因。通過雙酶切定向克隆于原核表達載體pET30a中,構(gòu)建原核表達載體pET30a-vgrG。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主菌BL21(DE3)中,構(gòu)建相應(yīng)的表達菌株BL21-pET30a-vgrG。經(jīng)過1.0mM IPTG誘導(dǎo)后可表達分子量為73 kDa的融合蛋白,進一步通過SDS-PAGE分析表明融合蛋白位于包涵體中。純化蛋白后免疫新西蘭大白兔,獲得免疫血清,經(jīng)過ELISA鑒定具有良好的特異性。2.禽致病性大腸桿菌T6SS2 vgrG基因突變株、互補株構(gòu)建及其特性分析為研究T6SS2核心組分VgrG在APEC致病過程中的作用,本研究利用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建DE719的vgrG基因缺失株,并通過低拷貝質(zhì)粒pSTV28構(gòu)建vgrG缺失互補株。通過系列生物學特性試驗比較分析野生株、缺失株與互補株的生長特性、運動性、生物被膜形成能力、黏附侵襲能力、動物致病力等差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)vgrG基因缺失株和互補株有較好的遺傳穩(wěn)定性,且二者的生長速度和運動能力與野生株相比沒有明顯差異,提示vgrG基因與APEC的生長繁殖和運動性無關(guān)。另外,T6SS2核心組分VgrG不影響DE719生物被膜的形成。細胞黏附試驗結(jié)果顯示,vgrG基因缺失株對DF-1細胞的黏附能力增強。致病性試驗表明缺失VgrG導(dǎo)致APEC的體內(nèi)定殖能力及致病力顯著下降,在APEC感染過程中發(fā)揮重要作用,為了解APEC的致病作用提供參考。3.禽致病性大腸桿菌cpxR基因缺失株、互補株構(gòu)建及其特性分析本研究利用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建DE719的cpxR基因缺失株,并通過低拷貝質(zhì)粒pSTV28構(gòu)建cpxR缺失互補株。通過一系列試驗分析比較野生株、cpxR基因缺失株及cpxR基因互補株的生物學特性、致病力、T6SS2基因表達水平,探討cpxR基因?qū)PEC致病性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)cpxR基因缺失株和互補株有較好的遺傳穩(wěn)定性,且其生長速度、運動能力和生物被膜形成能力與野生株相比沒有明顯差異,提示cpxR與APEC的生長繁殖、運動性和生物被膜形成能力無關(guān)。血清殺菌試驗結(jié)果表明,cpxR基因缺失株的抗血清殺菌能力明顯低于野生株。感染試驗結(jié)果顯示,cpxR缺失導(dǎo)致APEC對DF-1細胞的黏附能力及動物致病力顯著下降。熒光定量PCR結(jié)果顯示cpxR基因缺失株的T6SS2效應(yīng)因子vgrG、hcp1、hcp2的表達水平下調(diào),可能與APEC的致病力及生存有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：禽致病性大腸桿菌 Ⅵ型分泌系統(tǒng) vgrG cpxR 缺失
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 符號及英文縮略表9-10
• 文獻綜述10-34
• 第一章 禽致病性大腸桿菌概述10-21
• 參考文獻16-21
• 第二章 Ⅵ型分泌系統(tǒng)、Cpx雙組分系統(tǒng)概述21-34
• 參考文獻29-34
• 第三章 禽致病性大腸桿菌T6SS2核心組分vgrG基因的克隆表達34-43
• 1 材料34-36
• 2 方法36-39
• 3 結(jié)果39-40
• 4 討論40-42
• 參考文獻42-43
• 第四章 禽致病性大腸桿菌T6SS基因vgrG突變株、互補株構(gòu)建及特性分析43-59
• 1 材料43-44
• 2 方法44-49
• 3 結(jié)果49-54
• 4 討論54-57
• 參考文獻57-59
• 第五章 禽致病性大腸桿菌cpxR基因突變株、互補株構(gòu)建及生物學特性分析59-71
• 1 材料59
• 2 方法59-63
• 3 結(jié)果63-68
• 4 討論68-70
• 參考文獻70-71
• 全文總結(jié)71-72
• 致謝72-73

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