本文關(guān)鍵詞：羊布魯氏菌UGPase缺失株的構(gòu)建及菌殼的免疫特性研究

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【摘要】：布魯氏菌是一種能感染人和動(dòng)物的革蘭氏陰性桿菌,該菌所引起的布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱布病)廣泛流行于世界各地,對(duì)人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響。2000年以后,我國(guó)人畜布病流行廣泛,危害巨大,已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。布病難以防控的主要原因有三個(gè)方面:一是其致病與免疫機(jī)理不清楚或不完全清楚;二是診斷技術(shù)相對(duì)落后;三是現(xiàn)有的疫苗毒副作用大,免疫效果差,特別是免疫動(dòng)物與自然感染的動(dòng)物不能區(qū)別。為此,研究更安全,帶有可鑒別的分子標(biāo)記疫苗具有重要的理論和實(shí)踐意義,是我國(guó)布病防控研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。本研究的主要目的是在構(gòu)建出羊布魯氏菌UGPase缺失株的基礎(chǔ)上,制備菌殼疫苗株,研究其免疫原性,為布病分子標(biāo)記菌殼疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。UGPase是我們課題組在前期比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的一種在強(qiáng)毒株中高表達(dá),疫苗株中低表達(dá)的蛋白,經(jīng)鑒定證實(shí)該蛋白是尿苷三磷酸-葡糖糖-1-磷酸-尿苷�；D(zhuǎn)移酶(UTP-glucose-1-phosphateuridyly ltransferase,UGPase),是一個(gè)與糖原合成相關(guān)的酶。細(xì)菌菌殼(Bacterial ghosts)是缺失了細(xì)胞內(nèi)容物(胞漿、核酸等),無(wú)繁殖能力的細(xì)菌空殼。自然環(huán)境中的菌殼是大腸桿菌在感染了噬菌體Phi X174后,細(xì)胞裂解而形成的;人工制備菌殼主要是利用基因工程技術(shù),讓噬菌體Phi X174的裂解基因E在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá),在菌體表面形成40-200nm直徑的跨膜孔道,致使菌體內(nèi)外滲透壓改變,內(nèi)容物外流形成空殼形態(tài)。細(xì)菌在形成菌殼的過(guò)程中不經(jīng)歷物理和化學(xué)變性處理,從而保留了天然的細(xì)菌胞膜和表面抗原結(jié)構(gòu),免疫原性得以保留,目前作為一種新型候選疫苗,廣泛應(yīng)用在多種革蘭氏陰性細(xì)菌的研究當(dāng)中。本研究利用同源重組方法,構(gòu)建了含UGPase基因的重組自殺性質(zhì)粒p BK-S-F-R,在自殺性質(zhì)粒的介導(dǎo)下與等位基因進(jìn)行交換,運(yùn)用兩步篩選法對(duì)重組菌經(jīng)行篩選,經(jīng)PCR鑒定表明ΔUGP缺失株構(gòu)建成功。隨后分別用布魯氏菌16M株、ΔUGP缺失株、M5疫苗株對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7進(jìn)行了粘附侵襲實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物攻毒試驗(yàn),結(jié)果表明ΔUGP缺失株與強(qiáng)毒株16M在對(duì)寄主細(xì)胞的侵襲粘附能力和毒力上都沒(méi)有顯著差異。為了探討缺失基因UGPase是否可作為候選疫苗標(biāo)記的可能,本研究將含有溫控裂解功能的廣宿主表達(dá)質(zhì)粒p BBR1MCS-2-TLC,點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化入ΔUGP缺失株,通過(guò)誘導(dǎo)、篩選,制備了羊布魯氏菌ΔUGP菌殼疫苗株。接著,對(duì)布魯氏菌菌殼疫苗株的溶菌動(dòng)力學(xué)進(jìn)行試驗(yàn)分析,經(jīng)誘導(dǎo)條件優(yōu)化,在培養(yǎng)至OD600值為0.5時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo),誘導(dǎo)48h后,可制備得到裂解率達(dá)99.99%的羊布魯氏菌菌殼,所制菌殼數(shù)約為5.62×109cfu/m L。通過(guò)對(duì)過(guò)羊布魯氏菌ΔUGP株菌殼疫苗、羊布魯氏菌16M甲醛滅活疫苗和羊布魯氏菌M5弱毒苗抗體消長(zhǎng)規(guī)律和小鼠脾T淋巴細(xì)胞亞群的研究分析,證實(shí)了該菌殼具有良好的免疫原性。綜上結(jié)果,得出以下結(jié)論:1.成功構(gòu)建了強(qiáng)毒株羊布魯氏菌16MUGPase基因缺失株,首次證實(shí)UGPase與布魯氏菌毒力相關(guān)性不顯著。2.研制了羊布魯氏菌UGPase缺失菌殼疫苗株,裂解率可達(dá)99.99%。3.研制的菌殼疫苗具有良好的免疫原性。
【關(guān)鍵詞】：羊布魯氏菌 菌殼疫苗株 毒力 免疫原性 溶菌動(dòng)力學(xué)
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-10
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述10-19
• 第一章 布魯氏菌病及其研究概況10-16
• 1.1 布魯氏菌病的分布及其危害10-11
• 1.2 人間布病11
• 1.3 布病的主要毒力因子11-14
• 1.4 布魯氏菌病疫苗14-16
• 第二章 細(xì)菌菌殼技術(shù)研究進(jìn)展16-19
• 2.1 菌殼的裂解機(jī)理16-17
• 2.2 菌殼的制備及應(yīng)用17
• 2.3 菌殼疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)17-19
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容19-50
• 第一章 羊布魯氏菌 16MΔUGP株的構(gòu)建及鑒定19-28
• 1.1 材料19-20
• 1.2 方法20-23
• 1.3 結(jié)果23-26
• 1.4 討論26-27
• 1.5 小結(jié)27-28
• 第二章 羊布魯氏菌 16MΔUGP株的毒力實(shí)驗(yàn)28-34
• 2.1 材料28
• 2.2 方法28-29
• 2.3 結(jié)果29-32
• 2.4 討論32-33
• 2.5 小結(jié)33-34
• 第三章 羊布魯氏菌 16MΔUGP菌殼的制備及溶菌動(dòng)力學(xué)研究34-43
• 3.1 材料34
• 3.2 方法34-36
• 3.3 結(jié)果36-41
• 3.4 討論41-42
• 3.5 小結(jié)42-43
• 第四章 羊布魯氏菌 16MΔUGP-BG的免疫特性研究43-50
• 4.1 材料43-44
• 4.2 方法44-45
• 4.3 結(jié)果45-48
• 4.4 討論48-49
• 4.5 小結(jié)49-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-59
• 附錄59-60
• 作者簡(jiǎn)介60-61
• 致謝61

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本文編號(hào)：1001292