發(fā)布時間：2017-10-08 11:12

  本文關(guān)鍵詞：磷酸鹽耗竭反應(yīng)系統(tǒng)對綠膿桿菌群體感應(yīng)的影響及相應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子研究

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【摘要】：綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa),屬假單胞菌屬(Pseudomonas),廣泛存在于水、空氣、土壤及動物和人的皮膚、消化道、呼吸道、尿道和腸道中,是一種條件致病菌,在特定的合適條件下能引起人和動物的感染發(fā)病。綠膿桿菌目前已成為危害人類健康及養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疫病,其生物毒性主要是通過級聯(lián)式的群體感應(yīng)系統(tǒng)Quorum sensing system,QS)介導(dǎo)的。群體感應(yīng)系統(tǒng)是一個依賴于細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的基因調(diào)控系統(tǒng),在綠膿桿菌中分別表現(xiàn)為las、rhl以及pqs系統(tǒng),其中l(wèi)as系統(tǒng)位于級聯(lián)反應(yīng)的頂端。低磷酸鹽離子濃度條件下的綠膿桿菌,利用IQS系統(tǒng),在低磷響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄激活因子Pho B的調(diào)控下,越過las系統(tǒng),激活rhl以及pqs系統(tǒng),表現(xiàn)生物毒性。在臨床上,磷酸耗竭(phosphate depletion)是外科手術(shù)病人常見狀況,此逆境條件常常導(dǎo)致包括綠膿桿菌引起的多種細(xì)菌病害的加重加劇,甚至導(dǎo)致死亡。我們通過HPLC和LC-MS的方法,分析高磷和低磷培養(yǎng)條件下的生物發(fā)酵液中信號變化趨勢,進(jìn)一步確定了環(huán)境中無機(jī)磷酸鹽離子對綠膿桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響。為進(jìn)一步闡明IQS調(diào)控機(jī)理及信號通路,我們利用轉(zhuǎn)錄組高通量測序的手段,確定了兩個轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因PA3045和PA2665。PA3045在HP-Las R和HP-PAO1比對,表達(dá)量顯著的下調(diào),下調(diào)倍數(shù)2.02,是雙組分系統(tǒng)中的效應(yīng)器,對應(yīng)的感受器是PA3044;PA2665在LP-Pho B與HP-PhoB比對,表達(dá)量顯著的上調(diào),上調(diào)倍數(shù)2.07,是一種厭氧一氧化氮還原酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。PA2665位于黃素血紅蛋白基因上游,能調(diào)控其啟動子中感受NO變化區(qū)域,從而調(diào)控黃素血紅蛋白基因表達(dá)。對雙組分系統(tǒng)PA3044、PA3045以及PA2665進(jìn)行基因敲除和互補(bǔ)試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)PA3044對群體感應(yīng)基因調(diào)控?zé)o顯著影響。PA3045、PA2665敲除,對比野生型,生物膜產(chǎn)量增強(qiáng),彈性蛋白酶產(chǎn)量增加,AHL信號產(chǎn)量增強(qiáng),綠膿菌素產(chǎn)量也有一定程度增加,在運(yùn)動性方面,swimming無影響,swarming相較于野生型增強(qiáng),半徑增大。這表明PA3045、PA2665均為負(fù)調(diào)控因子,能夠影響綠膿桿菌諸多毒力因子表達(dá),如生物膜、彈性蛋白酶、運(yùn)動性等。由于日漸增多的抗菌藥物的使用,病菌多重耐藥、菌群失調(diào)等多種負(fù)面應(yīng)用不斷產(chǎn)生,細(xì)菌對抗菌藥物耐藥性的迅速增加已嚴(yán)重威脅到人類健康,多重耐藥菌株的出現(xiàn)顯著增加了患者的病死率和醫(yī)療費(fèi)用,影響醫(yī)療質(zhì)量。綠膿桿菌中的多種毒力因子表達(dá)及生物膜的形成都受到群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控,研究綠膿桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng),探明調(diào)控機(jī)理。通過干擾群體感應(yīng)信號通路,使病原菌無法對抗宿主免疫防御系統(tǒng),易于被宿主機(jī)體自身清除。這為研制新的治療綠膿桿菌感染藥物帶來新的思路。本文從DNA水平驗(yàn)證PA3045、PA2665調(diào)控作用,為進(jìn)一步找尋其信號通路,完善綠膿桿菌群體感應(yīng)通訊系統(tǒng)打下基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：綠膿桿菌 調(diào)控因子 群體感應(yīng) 調(diào)控機(jī)理 磷酸耗竭逆境
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 前言10-21
• 1.1 綠膿桿菌概況10-13
• 1.1.1 綠膿桿菌危害10
• 1.1.2 綠膿桿菌的致病機(jī)理10-11
• 1.1.3 綠膿桿菌的耐藥機(jī)理11-13
• 1.2 群體感應(yīng)的發(fā)現(xiàn)及研究進(jìn)展13-17
• 1.2.1 群體感應(yīng)信號分子14-15
• 1.2.2 綠膿桿菌中群體感應(yīng)的發(fā)現(xiàn)及研究進(jìn)展15-17
• 1.3 本論文研究內(nèi)容、目的及意義17-21
• 2 化學(xué)定性分析磷酸鹽對綠膿桿菌的影響21-24
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法21
• 2.1.1 菌株及培養(yǎng)基21
• 2.1.2 主要試劑及儀器21
• 2.1.3 發(fā)酵條件及發(fā)酵液的萃取、餾分的收集21
• 2.1.4 HPLC定性分析條件21
• 2.2 結(jié)果與分析21-23
• 2.2.1 HPLC結(jié)果分析21-23
• 2.3 討論與結(jié)論23-24
• 3 轉(zhuǎn)錄組測序分析磷酸鹽對綠膿桿菌的影響24-37
• 3.1 材料與方法24-27
• 3.1.1 菌株與培養(yǎng)條件24
• 3.1.2 細(xì)菌總RNA的提取24-25
• 3.1.3 細(xì)菌RNA質(zhì)量檢測25
• 3.1.4 文庫構(gòu)建和RNA-Seq測序25-26
• 3.1.5 RNA-Seq信息學(xué)分析26-27
• 3.1.6 轉(zhuǎn)錄組功能預(yù)測27
• 3.2 結(jié)果與分析27-36
• 3.2.1 細(xì)菌RNA的提取27-28
• 3.2.2 RNA檢測結(jié)果28
• 3.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果28-29
• 3.2.4 GO功能注釋29-35
• 3.2.5 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子篩選35-36
• 3.3 結(jié)論與討論36-37
• 4 綠膿桿菌轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中差異顯著基因的敲除與功能分析37-58
• 4.1 材料與方法37-46
• 4.1.1 菌株、質(zhì)粒與引物37-38
• 4.1.2 主要試劑與儀器38-39
• 4.1.3 培養(yǎng)基、菌株培養(yǎng)條件及抗生素使用濃度39
• 4.1.4 PAO1基因組DNA的提取39-40
• 4.1.5 敲除載體pK18和互補(bǔ)載體pUCP18的質(zhì)粒提取40-41
• 4.1.6 E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞的制備41
• 4.1.7 基因缺失突變體的獲得41-46
• 4.1.8 互補(bǔ)體的獲得46
• 4.2 突變體與互補(bǔ)體的表型測定46-47
• 4.2.1 運(yùn)動性檢測——swimming、swarming46
• 4.2.2 生物膜檢測46
• 4.2.3 彈性蛋白酶檢測46-47
• 4.2.4 AHL信號檢測47
• 4.2.5 綠膿菌素檢測47
• 4.3 結(jié)果與分析47-56
• 4.3.1 基因缺失突變體的構(gòu)建47-49
• 4.3.2 突變體的表型結(jié)果分析49-56
• 4.4 結(jié)論與討論56-58
• 5 總結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)及進(jìn)一步研究設(shè)想58-60
• 5.1 總結(jié)論58
• 5.2 創(chuàng)新點(diǎn)58-59
• 5.3 進(jìn)一步研究設(shè)想59-60
• 致謝60-61
• 參考文獻(xiàn)61-67

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：993688