本文關(guān)鍵詞：人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因shRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建及其病毒包裝鑒定

  更多相關(guān)文章： 宮頸癌 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因 小發(fā)卡RNA 慢病毒載體 Caski細胞

【摘要】：目的:構(gòu)建攜帶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(hTERT)慢病毒表達載體LV3-shRNA-hTERT及其病毒包裝鑒定并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宮頸癌Caski細胞系。方法:使用Designer3.0(Genepharma)軟件設(shè)計靶向hTERT的小發(fā)卡RNA(shRNA)序列,將hTERT-shRNA基因片段插入慢病毒載體pGLV3/H1/GFP+Puro中,構(gòu)建慢病毒表達質(zhì)粒LV3-shRNA-hTERT。通過酶切、DNA測序驗證hTERT片段的準確性,將LV3-shRNA-hTERT與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,濃縮上清并測定病毒滴度獲得重組慢病毒,將該重組慢病毒感染Caski細胞,通過觀測綠色熒光蛋白(GFP)的表達判斷轉(zhuǎn)染成功與否以及估計轉(zhuǎn)染效率,RTPCR、Western blot分別測定轉(zhuǎn)染后不同時間點的hTERTmRNA水平和hTERT蛋白表達情況,TRAP-ELISA法測定細胞端粒酶活性。結(jié)果:LV3-shRNA-hTERT攜帶正確hTERT基因,重組病毒經(jīng)PCR證實hTERT-shRNA基因插入。利用重組慢病毒介導(dǎo)將重組質(zhì)粒LV3-shRNA-hTERT高效轉(zhuǎn)導(dǎo)入宮頸癌Caski細胞并穩(wěn)定表達,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后24 h Caski細胞即開始發(fā)出綠色熒光,72 h后有大量熒光表達,而在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Caski細胞中不表達。檢測轉(zhuǎn)染后的Caski細胞,發(fā)現(xiàn)有3條鏈能明顯抑制hTERT mRNA和蛋白水平的表達,并顯著降低了細胞端粒酶活性,其中以72H-TERT-1515抑制作用最強,對hTERTmRNA和蛋白的抑制率分別達75.0%和70.3%,端粒酶活性下降74.6%。結(jié)論:成功構(gòu)建攜帶hTERT-shRNA慢病毒表達載體LV3-shRNA-hTERT,并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Caski細胞系,實驗設(shè)計的shRNA能有效抑制宮頸癌Caski細胞hTERT mRNA水平和hTERT蛋白表達,并顯著降低細胞端粒酶活性。為端粒酶在宮頸癌發(fā)病機制的研究、宮頸癌基因治療的體外干擾治療奠定了工作基礎(chǔ)。
【作者單位】： 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科;廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科;廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所;
【關(guān)鍵詞】： 宮頸癌 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因 小發(fā)卡RNA 慢病毒載體 Caski細胞
【基金】：廣西自然科學(xué)基金項目〔2013GXNSFAA019254〕 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費科研課題〔Z2013013〕 廣西研究生教育創(chuàng)新計劃資助項目〔YCBZ2013015〕
【分類號】：R393
【正文快照】： 宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,是女性生殖系統(tǒng)第二大腫瘤。雖然宮頸癌的發(fā)病機制尚未完全明確,但目前已獲得公認的是高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)感染是發(fā)生宮頸癌的必要因素。宿主細胞感染后,HR-HPV E6蛋白能誘發(fā)端粒改變及端粒酶激活,而端粒酶異常表達可使細胞逃避衰老、

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本文編號：951858