發(fā)布時(shí)間：2017-09-30 19:22

  本文關(guān)鍵詞：馬爾尼菲青霉菌雙相轉(zhuǎn)換相關(guān)基因AmyR和ctf1β功能的初步研究

  更多相關(guān)文章： 馬爾尼菲青霉菌 內(nèi)參基因 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 雙相轉(zhuǎn)換 轉(zhuǎn)錄因子 基因敲除

【摘要】：研究背景馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei,PM)是一種溫度依賴性雙相型條件致病真菌,可感染免疫缺陷人群,區(qū)域流行于東南亞地區(qū)和我國南方。近年來,隨著HIV患者的增加,導(dǎo)致全球范圍內(nèi)馬爾尼菲青霉菌病患病率大幅度升高,已經(jīng)嚴(yán)重影響到人類健康,但其雙相轉(zhuǎn)換和致病性分子機(jī)制尚不清楚。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是馬爾尼菲青霉菌雙相轉(zhuǎn)換和致病性分子機(jī)制研究的重要手段,但是仍缺乏用于馬爾尼菲青霉菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)化分析的理想的內(nèi)參基因。本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)篩選了四個(gè)表達(dá)最穩(wěn)定的基因Pfp;Rpl23;FacpA;DigA與傳統(tǒng)的內(nèi)參基因18SrRNA;β-actin(Act1); β-tubulin(Btu)作為候選內(nèi)參基因,用BestKeeper和geNorm軟件對(duì)其進(jìn)行基因表達(dá)穩(wěn)定性分析,以期獲得理想的內(nèi)參基因。近年來,普遍認(rèn)為馬爾尼菲青霉菌致病的分子機(jī)制與其雙相轉(zhuǎn)變過程密切相關(guān)。對(duì)馬爾尼菲青霉菌雙相轉(zhuǎn)換過程中4個(gè)不同生長時(shí)期的菌株進(jìn)行鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序和比較分析,篩選出在雙相轉(zhuǎn)換過程中差異表達(dá)明顯的基因,如AmyR和ctf1β。因此推測這兩個(gè)基因調(diào)控雙相轉(zhuǎn)換過程并且參與致病過程。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序的注釋,發(fā)現(xiàn)AmyR和ctf1β是C6轉(zhuǎn)錄因子基因,分別調(diào)控菌株水解淀粉的過程和降解角質(zhì)的功能。通過研究這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因的功能,可能會(huì)對(duì)發(fā)掘馬爾尼菲青霉菌的分子致病機(jī)制提供重要線索。目的：1在篩選出理想內(nèi)參基因的前提下,將qRT-PCR的精確標(biāo)準(zhǔn)化分析充分應(yīng)用于雙相轉(zhuǎn)換和致病分子機(jī)制研究；2通過對(duì)雙相轉(zhuǎn)換過程中差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因AmyR和ctf1β的功能初步研究,為揭示分子致病機(jī)制提供線索。方法：1根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果篩選出穩(wěn)定表達(dá)的基因并且選取常用內(nèi)參基因作為候選內(nèi)參基因,對(duì)其Ct值進(jìn)行一系列軟件分析篩選出理想內(nèi)參基因；2利用同源重組分子生物學(xué)等方法,建立目的基因敲除突變株,與初始菌株進(jìn)行對(duì)比研究,初步解析基因功能。結(jié)果：1 FacpA和DigA基因在馬爾尼菲青霉菌雙相轉(zhuǎn)換過程中表達(dá)最為穩(wěn)定,可作為內(nèi)參基因用于馬爾尼菲青霉菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)化分析；2成功構(gòu)建AmyR和ctf1β基因敲除菌株,在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、藥敏實(shí)驗(yàn)和壓力應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),對(duì)照菌株和基因突變菌株在巨噬細(xì)胞吞噬、藥物敏感性以及對(duì)抗壓力方面存在明顯差異,AmyR基因確實(shí)參與菌株水解淀粉過程。討論：實(shí)時(shí)熒光定量PCR是馬爾尼菲青霉菌雙相轉(zhuǎn)換和致病性分子機(jī)制研究的重要手段,在不同的實(shí)驗(yàn)室中,研究者會(huì)選擇不同的內(nèi)參基因作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。因此有必要在馬爾尼菲青霉菌中篩選鑒定出一套更理想的內(nèi)參基因用于qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化分析,本研究篩選出FacpA和DigA基因可作為內(nèi)參基因用于馬爾尼菲青霉菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)化分析。轉(zhuǎn)錄因子基因功能的初步研究主要包括：轉(zhuǎn)錄因子基因敲除前后其相關(guān)基因表達(dá)量的變化；基因敲除株的形態(tài)學(xué)變化；巨噬細(xì)胞吞噬以及在巨噬細(xì)胞內(nèi)寄生的生長形態(tài)變化；藥物敏感性變化和△AmyR菌株水解淀粉能力的改變進(jìn)行研究。上述所得結(jié)果可以初步解析轉(zhuǎn)錄因子基因功能,將為雙相型真菌形態(tài)轉(zhuǎn)換、分子致病機(jī)制等研究奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：馬爾尼菲青霉菌 內(nèi)參基因 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 雙相轉(zhuǎn)換 轉(zhuǎn)錄因子 基因敲除
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R379
【目錄】：

• 個(gè)人簡歷3-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 第一章 基于轉(zhuǎn)錄組測序的馬爾尼菲青霉菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因篩選與鑒定13-32
• 前言13-14
• 1 材料與方法14-22
• 1.1 實(shí)驗(yàn)菌株14
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器14-16
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法16-22
• 2 結(jié)果與分析22-30
• 2.1 馬爾尼菲青霉菌FRR2161、GXFF總RNA的提取22-23
• 2.2 基于轉(zhuǎn)錄組RNA測序的候選內(nèi)參基因篩選23-24
• 2.3 候選內(nèi)參基因熒光定量PCR引物特異性分析24
• 2.4 候選內(nèi)參基因熒光定量PCR擴(kuò)增效率分析24-27
• 2.5 顯著差異表達(dá)候選內(nèi)參基因One Way ANOVA分析27
• 2.6 利用geNorm軟件分析內(nèi)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性27-29
• 2.7 利用BestKeeper軟件分析內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性29-30
• 3 討論30-32
• 第二章 馬爾尼菲青霉菌AmyR和ctf1β基因功能的初步研究32-81
• 前言32-35
• 1 材料和方法35-63
• 1.1 實(shí)驗(yàn)菌株35
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器35-42
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法42-63
• 2 結(jié)果63-79
• 2.1 馬爾尼菲青霉菌AmyR、ctf1β聲基因缺失突變載體的構(gòu)建63-65
• 2.2 馬爾尼菲青霉菌AmyR和ctf1β基因缺失突變體的初步篩選65-66
• 2.3 熒光定量PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選鑒定和外源基因插入拷貝數(shù)檢測66-68
• 2.4 熒光定量PCR對(duì)AmyR、ctf1β轉(zhuǎn)錄因子基因相關(guān)基因表達(dá)量的檢測68-70
• 2.5 基因突變菌株RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)70-74
• 2.6 ΔAmyR基因突變菌株的淀粉水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果74-76
• 2.7 基因突變株藥物敏感、抗氧化、細(xì)胞壁完整性和滲透壓敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果76-79
• 3 討論79-81
• 小結(jié)81-83
• 參考文獻(xiàn)83-88
• 綜述88-108
• 參考文獻(xiàn)99-108
• 附錄108-109
• 致謝109-111
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄111-112
• 附件112

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