本文關鍵詞：馬爾尼菲青霉菌雙相轉換相關基因AmyR和ctf1β功能的初步研究

  更多相關文章： 馬爾尼菲青霉菌 內參基因 實時熒光定量PCR 雙相轉換 轉錄因子 基因敲除

【摘要】：研究背景馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei,PM)是一種溫度依賴性雙相型條件致病真菌,可感染免疫缺陷人群,區(qū)域流行于東南亞地區(qū)和我國南方。近年來,隨著HIV患者的增加,導致全球范圍內馬爾尼菲青霉菌病患病率大幅度升高,已經嚴重影響到人類健康,但其雙相轉換和致病性分子機制尚不清楚。實時熒光定量PCR是馬爾尼菲青霉菌雙相轉換和致病性分子機制研究的重要手段,但是仍缺乏用于馬爾尼菲青霉菌實時熒光定量PCR標準化分析的理想的內參基因。本研究根據轉錄組測序數(shù)據篩選了四個表達最穩(wěn)定的基因Pfp;Rpl23;FacpA;DigA與傳統(tǒng)的內參基因18SrRNA;β-actin(Act1); β-tubulin(Btu)作為候選內參基因,用BestKeeper和geNorm軟件對其進行基因表達穩(wěn)定性分析,以期獲得理想的內參基因。近年來,普遍認為馬爾尼菲青霉菌致病的分子機制與其雙相轉變過程密切相關。對馬爾尼菲青霉菌雙相轉換過程中4個不同生長時期的菌株進行鏈特異性轉錄組測序和比較分析,篩選出在雙相轉換過程中差異表達明顯的基因,如AmyR和ctf1β。因此推測這兩個基因調控雙相轉換過程并且參與致病過程。根據轉錄組測序的注釋,發(fā)現(xiàn)AmyR和ctf1β是C6轉錄因子基因,分別調控菌株水解淀粉的過程和降解角質的功能。通過研究這兩個轉錄因子基因的功能,可能會對發(fā)掘馬爾尼菲青霉菌的分子致病機制提供重要線索。目的：1在篩選出理想內參基因的前提下,將qRT-PCR的精確標準化分析充分應用于雙相轉換和致病分子機制研究；2通過對雙相轉換過程中差異表達轉錄因子基因AmyR和ctf1β的功能初步研究,為揭示分子致病機制提供線索。方法：1根據轉錄組測序結果篩選出穩(wěn)定表達的基因并且選取常用內參基因作為候選內參基因,對其Ct值進行一系列軟件分析篩選出理想內參基因；2利用同源重組分子生物學等方法,建立目的基因敲除突變株,與初始菌株進行對比研究,初步解析基因功能。結果：1 FacpA和DigA基因在馬爾尼菲青霉菌雙相轉換過程中表達最為穩(wěn)定,可作為內參基因用于馬爾尼菲青霉菌實時熒光定量PCR標準化分析；2成功構建AmyR和ctf1β基因敲除菌株,在細胞實驗、藥敏實驗和壓力應激實驗中發(fā)現(xiàn),對照菌株和基因突變菌株在巨噬細胞吞噬、藥物敏感性以及對抗壓力方面存在明顯差異,AmyR基因確實參與菌株水解淀粉過程。討論：實時熒光定量PCR是馬爾尼菲青霉菌雙相轉換和致病性分子機制研究的重要手段,在不同的實驗室中,研究者會選擇不同的內參基因作為衡量標準。因此有必要在馬爾尼菲青霉菌中篩選鑒定出一套更理想的內參基因用于qRT-PCR標準化分析,本研究篩選出FacpA和DigA基因可作為內參基因用于馬爾尼菲青霉菌實時熒光定量PCR標準化分析。轉錄因子基因功能的初步研究主要包括：轉錄因子基因敲除前后其相關基因表達量的變化；基因敲除株的形態(tài)學變化；巨噬細胞吞噬以及在巨噬細胞內寄生的生長形態(tài)變化；藥物敏感性變化和△AmyR菌株水解淀粉能力的改變進行研究。上述所得結果可以初步解析轉錄因子基因功能,將為雙相型真菌形態(tài)轉換、分子致病機制等研究奠定基礎。
【關鍵詞】：馬爾尼菲青霉菌 內參基因 實時熒光定量PCR 雙相轉換 轉錄因子 基因敲除
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R379
【目錄】：

• 個人簡歷3-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 第一章 基于轉錄組測序的馬爾尼菲青霉菌實時熒光定量PCR內參基因篩選與鑒定13-32
• 前言13-14
• 1 材料與方法14-22
• 1.1 實驗菌株14
• 1.2 實驗試劑和儀器14-16
• 1.3 實驗方法16-22
• 2 結果與分析22-30
• 2.1 馬爾尼菲青霉菌FRR2161、GXFF總RNA的提取22-23
• 2.2 基于轉錄組RNA測序的候選內參基因篩選23-24
• 2.3 候選內參基因熒光定量PCR引物特異性分析24
• 2.4 候選內參基因熒光定量PCR擴增效率分析24-27
• 2.5 顯著差異表達候選內參基因One Way ANOVA分析27
• 2.6 利用geNorm軟件分析內候選內參基因表達穩(wěn)定性27-29
• 2.7 利用BestKeeper軟件分析內參基因表達穩(wěn)定性29-30
• 3 討論30-32
• 第二章 馬爾尼菲青霉菌AmyR和ctf1β基因功能的初步研究32-81
• 前言32-35
• 1 材料和方法35-63
• 1.1 實驗菌株35
• 1.2 實驗試劑和儀器35-42
• 1.3 實驗方法42-63
• 2 結果63-79
• 2.1 馬爾尼菲青霉菌AmyR、ctf1β聲基因缺失突變載體的構建63-65
• 2.2 馬爾尼菲青霉菌AmyR和ctf1β基因缺失突變體的初步篩選65-66
• 2.3 熒光定量PCR進行轉化子篩選鑒定和外源基因插入拷貝數(shù)檢測66-68
• 2.4 熒光定量PCR對AmyR、ctf1β轉錄因子基因相關基因表達量的檢測68-70
• 2.5 基因突變菌株RAW264.7鼠巨噬細胞實驗70-74
• 2.6 ΔAmyR基因突變菌株的淀粉水解實驗結果74-76
• 2.7 基因突變株藥物敏感、抗氧化、細胞壁完整性和滲透壓敏感性實驗結果76-79
• 3 討論79-81
• 小結81-83
• 參考文獻83-88
• 綜述88-108
• 參考文獻99-108
• 附錄108-109
• 致謝109-111
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄111-112
• 附件112

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本文編號：949959