本文關(guān)鍵詞：siIRE1α重組腺病毒對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡的影響

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【摘要】：目的構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)基因干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)重組腺病毒,并探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)狀態(tài)下其對C2C12細胞增殖凋亡的影響。方法人工合成靶向IRE1α的siRNA序列,連接到穿梭載體pSES-HUS上,與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1在大腸桿菌BJ5183感受態(tài)中進行同源重組,得到pAdSES-HUS-IRE1αsiRNA重組質(zhì)粒。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)在HEK293細胞中包裝并擴增重組腺病毒Ad-IRE1αsiRNA,在C2C12細胞中采用RT-PCR和Western blot檢測其干擾效果,并通過FCM法和MTT檢測Tm誘導(dǎo)ERS時病毒對C2C12細胞增殖凋亡的影響(分為4組:NC組、Tm單獨處理組、Tm+Ad-RFP組和Tm+AdIRE1αsiRNA組),Western blot檢測C2C12細胞中Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表達。結(jié)果成功獲得了病毒滴度約為4.3×1011PFU/mL的重組腺病毒Ad-IRE1αsiRNA。RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果表明,該重組腺病毒有效地抑制了C2C12細胞中IRE1α的表達。FCM檢測結(jié)果表明,ERS條件下,Tm+Ad-IRE1αsiRNA組S期的細胞比例分別比Tm單獨處理組和Tm+Ad-RFP組升高12.62%和14.80%(P0.05);凋亡率比Tm單獨處理組和Tm+Ad-RFP組降低16.64%和16.26%(P0.05)。MTT實驗結(jié)果與Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表達與FCM結(jié)果一致。結(jié)論重組腺病毒Ad-IRE1αsiRNA在C2C12細胞中能有效抑制IRE1α的表達;ERS狀態(tài)下,RNA干擾IRE1α基因可促進C2C12細胞的增殖,抑制其凋亡。
【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)及遺傳學(xué)教研室;
【關(guān)鍵詞】： IREα RNA干擾 重組腺病毒 CC細胞 增殖和凋亡
【基金】：國家自然科學(xué)基金(81371928,81171697) 教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(NCET-12-1090) 重慶市高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計劃(渝教人2011-65)~~
【分類號】：R3416
【正文快照】： 真核細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要負責(zé)膜蛋白和分泌性蛋白的合成、翻譯后修飾以及折疊等。當大量的未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)聚集時,超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的處理能力,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)就會遭到破壞,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulum stress,ERS),隨即激活一系列的保護性反應(yīng),以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài),即未

【參考文獻】

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【共引文獻】

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本文編號：931776