本文關鍵詞：靶向小鼠TNF-α基因RNA干擾慢病毒載體的構建及鑒定

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【摘要】：目的:構建靶向小鼠TNF-α基因的RNA干擾慢病毒載體,為RNA干擾基因治療提供基礎。方法:設計、合成3組靶向TNF-α基因的特異小干擾RNA(siRNA):siRNA1、siRNA2、siRNA3及陰性對照siRNA,體外轉染小鼠巨噬細胞株RAW264.7,用real-time PCR和ELISA法檢測其對經脂多糖刺激的RAW264.7細胞表達TNF-α、IL-1β、IL-6的影響。篩選出特異且抑制性高的siRNA,根據其序列設計合成寡核苷酸鏈,構建表達短發(fā)卡RNA(shRNA)的重組慢病毒質粒并測序,經鑒定質粒與包裝質粒共轉染293T細胞生產慢病毒顆粒,計算病毒顆粒滴度。結果:①siRNA1、siRNA2、siRNA3組的TNF-αmRNA相對表達量分別為0.24±0.01、0.16±0.02、0.19±0.01,與陰性對照0.95±0.02相比差別均具有統(tǒng)計學意義(F=531.3,P0.001);與陰性對照相比,mRNA表達抑制率分別為74.26%、83.09%、79.93%。siRNA1、siRNA2、siRNA3及陰性對照組的IL-1βmRNA或IL-6 mRNA相對表達量之間差別無統(tǒng)計學意義(F=0.981,P=0.980 70.05;F=0.739,P=0.586 70.05)。②siRNA1、siRNA2、siRNA3的TNF-α蛋白表達分別為(23.95±1.21)、(17.27±1.46)、(19.07±1.57)ng/ml與陰性對照的(35.37±2.93)ng/ml相比,差別均具有統(tǒng)計學意義(F=18.1,P=0.000 60.001);與陰性對照相比,TNF-α蛋白表達抑制率分別為32.29%、51.16%、46.08%。③以siRNA2序列設計、合成寡核苷酸鏈,構建重組慢病毒穿梭質粒,其PCR產物電泳結果為343 bp,空載體PCR產物306 bp;DNA測序顯示pGCSIL-GFP-shRNA測序反應中斷,但已顯示部分插入序列。④轉染后的293T細胞,生長良好,熒光表達強,慢病毒滴度為2×106TU/μl。結論:靶向小鼠TNF-α基因RNAi慢病毒載體構建成功。
【作者單位】： 青島大學附屬醫(yī)院風濕免疫科;青島大學附屬醫(yī)院中心實驗室;
【關鍵詞】： RNA干擾 慢病毒載體 巨噬細胞 腫瘤壞死因子-α
【基金】：山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金資助項目(2006BS03005)
【分類號】：R392.1
【正文快照】： RNA干擾(RNA interference,RNAi)是雙鏈RNA介導的、序列特異性的轉錄后基因沉默[1,2],為基因治療的方法之一。實施RNAi基因治療的關鍵為載體選擇,慢病毒載體具有表達時間長、低免疫原性、低細胞毒性且能有效轉染包括單核巨噬細胞、神經元細胞、胰腺細胞等多種難于轉染的細胞系

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7 沈上杭;王占祥;陳玉英;毛賀輝;;HIF-1α基因RNAi慢病毒載體的構建與鑒定[J];中國實用醫(yī)藥;2010年04期

8 毛賀輝;蘇國強;;FAK基因RNAi慢病毒載體的構建與鑒定[J];腫瘤防治研究;2010年12期

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10 李麗;張日;岑建農;朱子玲;;VEGF基因RNAi慢病毒載體的構建與鑒定[J];蘇州大學學報(醫(yī)學版);2008年01期

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1 劉峰;肖興鵬;田玉科;;大鼠蛋白激酶Cγ可控shRNA慢病毒的構建與鑒定[A];2011年全國醫(yī)藥學術論壇交流會暨臨床藥學與藥學服務研究進展培訓班論文集[C];2011年

2 薛美思;劉毅;;攜帶人胰島素基因慢病毒載體轉染臍帶間充質干細胞的實驗研究[A];中華醫(yī)學會整形外科學分會第十一次全國會議、中國人民解放軍整形外科學專業(yè)委員會學術交流會、中國中西醫(yī)結合學會醫(yī)學美容專業(yè)委員會全國會議論文集[C];2011年

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4 王云姣;程智剛;于鵬;李靖貽;白念岳;賀正華;楊勝輝;郭曲練;;攜帶dream基因shRNA的慢病毒載體的構建及其對CCI大鼠的鎮(zhèn)痛作用[A];中華醫(yī)學會疼痛學分會第八屆年會暨CASP成立二十周年論文集[C];2009年

5 郭瀛軍;郭嘉;張術;王開宇;高遠艦;何穎;孫樹漢;;慢病毒載體在疫苗研究中的應用[A];2005全國第二屆核酸疫苗研討會論文集[C];2005年

6 宋達疆;黃曉元;任利成;楊興華;肖目張;王雙;;TREM-1基因RNAi慢病毒載體的構建及功能初步檢測[A];中華醫(yī)學會燒傷外科學分會2009年學術年會論文匯編[C];2009年

7 方_g聃;孫鳳強;王娟;張帆;張敬之;;cHS4和SV40的2×USE的聯合作用能夠有效降低慢病毒載體的通讀率[A];遺傳學與社會可持續(xù)發(fā)展——2010中國青年遺傳學家論壇論文摘要匯編[C];2010年

8 黃憲章;王前;鄭磊;陳曉;熊石龍;包杰;丁海明;黃嫵姣;莊俊華;;人CDK2基因RNAi慢病毒載體的構建與鑒定[A];中華醫(yī)學會第七次全國檢驗醫(yī)學學術會議資料匯編[C];2008年

9 石瑛;程時剛;陳旭;肖傳國;;大鼠TORC1基因重組慢病毒的構建與鑒定[A];第十五屆全國泌尿外科學術會議論文集[C];2008年

10 熊石龍;王前;鄭磊;包杰;黃憲章;劉競爭;曾方銀;裘宇容;;慢病毒攜帶shRNA對內皮細胞組織因子表達的抑制作用[A];中華醫(yī)學會第七次全國檢驗醫(yī)學學術會議資料匯編[C];2008年

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1 張?zhí)锟?基因療法:沉寂之后的復蘇?[N];南方周末;2009年

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1 蘇冠華;肝細胞生長因子基因修飾的骨髓間充質干細胞移植的促血管新生作用[D];華中科技大學;2010年

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8 李偉;大鼠CRX基因的重組慢病毒載體LV-Rho-EGFP/CRX的構建和表達[D];中南大學;2008年

9 林長貴;慢病毒載體介導nanog基因修飾小鼠骨髓間充質干細胞[D];福建醫(yī)科大學;2008年

10 薛美思;攜帶重組人胰島素基因的慢病毒載體轉染人臍帶間充質干細胞的實驗研究[D];蘭州大學;2010年

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