本文關(guān)鍵詞：Integrins在間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞分化中的作用研究

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【摘要】：體內(nèi)外的研究證實間充質(zhì)干細胞(MSCs)可以向內(nèi)皮細胞分化,為血管組織工程提供種子細胞。實驗室前期工作已證實VEGF可以誘導骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)向內(nèi)皮細胞分化。Integrins(整合素)在血管內(nèi)皮細胞中有高表達,對血管生成起重要作用。本論文擬研究Integrins在VEGF誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞分化及其血管生成過程中的作用。首先用50 ng/mL VEGF誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞分化,利用LDL吸收實驗證實骨髓間充質(zhì)干細胞分化為內(nèi)皮細胞,能吸收DiI-Ac-LDL;然后通過Matrigel基質(zhì)膠成血管實驗證實骨髓間充質(zhì)干細胞的血管生成能力；利用RT-PCR和Western blot的方法檢測Integrins (Integrin α1、Integrin α5、Integrin αV、Integrin β1、Integrin β4、 Integrin β5)表達隨著誘導時間的增長有上升趨勢。前期實驗已證實Rho信號通路參與VEGF的誘導過程,因此為了驗證Integrins是否受到Rho信號通路的調(diào)控,本實驗分別利用兩種Rho信號通路抑制劑2 μg/mL C3或10 μmol/L Y27632對細胞進行預(yù)處理,然后用VEGF誘導分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細胞不能分化為內(nèi)皮細胞,且血管生成能力下降,Integrins的表達下降。已有研究證實Rho信號通路的活化會引起MRTF-A入核并激活下游靶基因,為進一步確定Integrins是否會受到MRTF-A的調(diào)控,通過在骨髓間充質(zhì)干細胞中分別轉(zhuǎn)染sh-MRTF-A干擾質(zhì)粒和合成的siMRTF-A抑制內(nèi)源性MRTF-A功能,然后用VEGF誘導分化。結(jié)果顯示,干擾MRTF-A組的骨髓間充質(zhì)干細胞不能分化為內(nèi)皮細胞,且血管生成能力下降,Integrins的表達也下降。利用劃痕實驗和Transwell遷移小室實驗證實骨髓間充質(zhì)干細胞的遷移能力下降。進一步通過熒光素酶報告基因分析實驗,證實MRTF-A對于Integrin α1和Integrin α5啟動子有轉(zhuǎn)錄激活作用。最后利用人臍靜脈血內(nèi)皮細胞系(HUVECs)進一步證實了MRTF-A對Integrins的調(diào)控作用。在HUVEC細胞中轉(zhuǎn)染siMRTF-A后再用VEGF處理。利用MTT檢測到干擾MRTF-A對細胞的增殖沒有顯著影響。鬼筆環(huán)肽染色、劃痕、transwell及matrigel實驗證實低表達MRTF-A的細胞粘附、遷移和血管生成能力均下降,細胞遷移特異性標志物MYL9和CYR61以及Integrins的表達降低。最后證實了MRTF-A對于Integrin α1和Integrin α5啟動子有轉(zhuǎn)錄激活作用。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細胞 內(nèi)皮細胞 Integrins 血管內(nèi)皮生長因子 MRTF-A Rho
【學位授予單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• abstract5-9
• 1 前言9-23
• 1.1 組織工程化血管的簡介9-10
• 1.1.1 組織工程9
• 1.1.2 血管組織工程9-10
• 1.1.3 血管內(nèi)皮細胞10
• 1.2 間充質(zhì)干細胞10-13
• 1.2.1 間充質(zhì)干細胞簡介10-11
• 1.2.2 骨髓間充質(zhì)干細胞11-12
• 1.2.3 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀12-13
• 1.3 VEGF13-15
• 1.3.1 VEGF及其受體簡介13-14
• 1.3.2 VEGF及其受體的功能14
• 1.3.3 VEGF誘導間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞分化的研究現(xiàn)狀14-15
• 1.4 Integrins15-16
• 1.4.1 Integrins簡介15-16
• 1.4.2 Integrins在間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞分化中的作用16
• 1.5 Rho信號通路16-18
• 1.6 MRTF-A18-20
• 1.6.1 MRTF-A的結(jié)構(gòu)18-19
• 1.6.2 MRTF-A的研究現(xiàn)狀19-20
• 1.7 研究目的及意義20-21
• 1.8 研究的主要內(nèi)容21-23
• 2 材料與方法23-48
• 2.1 實驗材料23-30
• 2.1.1 實驗細胞、動物、質(zhì)粒和菌株23
• 2.1.2 實驗儀器及設(shè)備23-24
• 2.1.3 實驗試劑及耗材24-26
• 2.1.4 常用溶液的配置26-30
• 2.2 實驗方法30-48
• 2.2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞的提取與培養(yǎng)30-31
• 2.2.2 人臍靜脈血內(nèi)皮細胞(HUVEC)和COS7細胞的培養(yǎng)31-32
• 2.2.3 細胞轉(zhuǎn)染32-34
• 2.2.4 DiI-Ac-LDL吸收實驗34
• 2.2.5 Matrigel基質(zhì)膠成血管實驗34
• 2.2.6 細胞劃痕實驗34-35
• 2.2.7 Transwell實驗35-36
• 2.2.8 RT-PCR檢測36-38
• 2.2.9 蛋白質(zhì)免疫印記(Western Blot)38-39
• 2.2.10 Integrins啟動子質(zhì)粒構(gòu)建39-44
• 2.2.11 MTT檢測細胞增殖44-45
• 2.2.12 鬼筆環(huán)肽染色實驗45-46
• 2.2.13 熒光素酶活性檢測(Luciferase)46-47
• 2.2.14 統(tǒng)計分析方法47-48
• 3 結(jié)果與討論48-70
• 3.1 骨髓間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞分化過程中Integrins的影響48-50
• 3.1.1 建立骨髓間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞分化的模型48
• 3.1.2 VEGF誘導BMSCs的血管生成實驗48-49
• 3.1.3 BMSCs向內(nèi)皮細胞分化過程中IntegrinsmRNA水平的表達49-50
• 3.1.4 BMSCs向內(nèi)皮細胞分化過程中Integrins蛋白水平的表達50
• 3.2 Rho信號通路參與VEGF的誘導過程并調(diào)控Integrins50-53
• 3.2.1 Rho信號通路對VEGF誘導分化的影響50-51
• 3.2.2 Rho信號通路參與VEGF誘導的BMSCs的血管生成51-52
• 3.2.3 Rho信號通路對VEGF誘導過程中IntegrinsmRNA水平表達的影響52
• 3.2.4 Rho信號通路對VEGF誘導過程中Integrins蛋白水平表達的影響52-53
• 3.3 MRTF-A參與VEGF誘導BMSCs向內(nèi)皮細胞分化的過程53-63
• 3.3.1 MRTF-A對VEGF誘導分化的影響53-54
• 3.3.2 MRTF-A參與VEGF誘導的BMSCs的遷移54-56
• 3.3.3 MRTF-A參與VEGF誘導的BMSCs的血管生成56-57
• 3.3.4 MRTF-A對VEGF誘導分化過程中IntegrinsmRNA水平表達的影響57-58
• 3.3.5 MRTF-A對VEGF誘導分化過程中Integrins蛋白水平表達的影響58
• 3.3.6 MRTF-A對Integrin α1和Integrin α5啟動子活性的影響58-63
• 3.4 MRTF-A對HUVEC細胞的作用63-70
• 3.4.1 MRTF-A對HUVEC細胞增殖的影響63-64
• 3.4.2 MRTF-A對HUVEC細胞粘附的影響64-65
• 3.4.3 MRTF-A對HUVEC細胞遷移的影響65-67
• 3.4.4 MRTF-A對HUVEC細胞成血管的影響67-68
• 3.4.5 MRTF-A對HUVEC細胞中Integrins的表達的影響68
• 3.4.6 HUVEC細胞中Integrin α1和Integrin α5啟動子熒光素酶活性分析68-70
• 4 結(jié)論70-71
• 5 展望71-72
• 6 參考文獻72-78
• 7 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文情況78-79
• 8 致謝79

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