糞菌移植治療小鼠艱難梭菌感染的安全性評價

發(fā)布時間：2017-09-25 22:31

本文關(guān)鍵詞：糞菌移植治療小鼠艱難梭菌感染的安全性評價

【摘要】：研究背景和目的艱難梭菌(Clostridium difficile, CD)是一種革蘭染色陽性、專性厭氧的粗大芽孢桿菌,在生存環(huán)境惡劣的情況下可形成次級端芽孢,主要在人與人之間通過糞口途徑傳播并定植于腸道。正常成人艱難梭菌無癥狀攜帶率為5-15%,住院患者可達57%,嬰幼兒艱難梭菌攜帶率比成人高,可達84.4%。艱難梭菌是院內(nèi)獲得性腹瀉的主要病原菌,也是社區(qū)獲得性腹瀉的重要致病菌。1978年,第一次發(fā)現(xiàn)了艱難梭菌與偽膜性腸炎(Pseudomembranous colitis. PMC)相關(guān)。正常情況下,艱難梭菌可存在于腸道中,并不致病。當長期大量應(yīng)用廣譜抗生素等原因造成腸道穩(wěn)態(tài)失衡,艱難梭菌過度繁殖,引起艱難梭菌相關(guān)性感染(Closrtidium difficile infection, CDI)的發(fā)生,可導(dǎo)致艱難梭菌感染相關(guān)性腹瀉(Clostridium difficile associated diarrhea, CDAD)。CDI是15%～25%抗生素相關(guān)性腹瀉(Antibiotic-associated diarrhea,AAD)的病因,也是幾乎所有抗生素相關(guān)性偽膜性結(jié)腸炎的病因。臨床上大多數(shù)患者感染艱難梭菌后無癥狀,表現(xiàn)為健康攜帶者；出現(xiàn)臨床癥狀者可表現(xiàn)為輕至重度水樣瀉、暴發(fā)性腸炎、偽膜性腸炎甚至感染性休克等全身癥狀。腹瀉癥狀常出現(xiàn)于應(yīng)用抗生素的過程中或是停用抗生素短期內(nèi),偶有停用數(shù)月后發(fā)病者。所有抗生素都可引起艱難梭菌感染,其中克林霉素、頭孢菌素類和喹諾酮類引起的感染風(fēng)險更高,而哌拉西林/他唑巴坦、替加環(huán)素等則很少引發(fā)CDI。目前CDI的標準治療方案是使用甲硝唑或萬古霉素,但高達25%的患者在使用這2種抗生素后30天內(nèi)可出現(xiàn)復(fù)發(fā),初次復(fù)發(fā)后再次復(fù)發(fā)率則可升高至40-65%。復(fù)發(fā)性CDI不僅難以治療,而且會影響患者數(shù)月甚至數(shù)年,降低其生活質(zhì)量,增加經(jīng)濟負擔。由于廣譜抗生素的濫用、高毒力菌株的出現(xiàn)、菌株耐藥率增加等因素,CDI的發(fā)病率逐年升高,特別是在近期有住院史或是長期居住在照護機構(gòu)的老年人群中。歐美國家曾多次發(fā)生爆發(fā)流行,流行期間病死率明顯升高,導(dǎo)致醫(yī)療保健費用隨之增加。為了更好地進行艱難梭菌感染發(fā)病機制的研究、疫苗的制備、新治療方案的評價等,須建立穩(wěn)定可靠的CDAD動物模型。倉鼠、豚鼠、無菌鼠、大鼠和小鼠都曾作為CDAD的模型動物。過去應(yīng)用最廣的是倉鼠模型,但由于倉鼠感染艱難梭菌后腹瀉癥狀重,是一種暴發(fā)性、致死性的疾病過程。這與國內(nèi)臨床上人體感染艱難梭菌的常見結(jié)局不同,無法完全代表人類的感染過程。由于發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)小鼠易感性增加的新方法以及可應(yīng)用于小鼠宿主組織分析的特異性試劑的改進等原因,近幾年小鼠CDI模型的應(yīng)用增加。Chen等發(fā)現(xiàn)經(jīng)過混合抗生素±克林霉素誘導(dǎo)后,C57BL/6小鼠可成功感染艱難梭菌并出現(xiàn)腹瀉,感染過程與人類相似,從而成為目前CDAD主要的模型動物。但我們前期研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用本課題組臨床分離菌株進行建模,C57BL/6模型鼠感染嚴重程度難控制,多數(shù)小鼠腹瀉程度較輕,呈自愈性,可能限制其在難治性及復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染研究中的應(yīng)用。故本研究選擇國內(nèi)科研常用的3種品系小鼠,擬構(gòu)建不同品系小鼠CDAD動物模型,并通過臨床和病理指標對動物模型進行評估,篩選出最具臨床代表性且穩(wěn)定的動物模型,為艱難梭菌感染相關(guān)研究提供可靠的實驗工具。糞菌移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)是指將健康人糞便中的功能菌群,移植到患者胃腸道內(nèi),重建具有正常功能的腸道菌群,從而達到治療腸道及腸道外疾病的目的。近十年來,因為在治療艱難梭菌感染方面療效突出,糞菌移植受到國內(nèi)外越來越多的關(guān)注。目前全世界已報道數(shù)千例應(yīng)用糞菌移植的病例,這些病例中包括胃腸道疾病(如艱難梭菌感染、炎癥性腸病、腸易激綜合征等)和非胃腸道疾病(如疲勞綜合征、特發(fā)性血小板減少性紫癜等)。糞菌移植治療難治性艱難梭菌感染有效率可達80%-90%,并且相較于應(yīng)用萬古霉素等治療方案,FMT療程短、花費少、效果明顯。2013年2月,美國食品及藥品監(jiān)督管理局將FMT寫入CDI治療指南中：建議在間歇性萬古霉素治療后第三次復(fù)發(fā)時,即可考慮使用FMT。雖然目前FMT已經(jīng)用于多種疾病的臨床治療,但是FMT作為一項尚不完全成熟的臨床治療手段,其長期安全性問題,還缺乏足夠的臨床和實驗室資料。最主要的不良反應(yīng)包括噯氣、腹脹、腹部絞痛等消化道癥狀；而部分患者在FMT后可出現(xiàn)低熱、腹瀉增加等小腸細菌過度生長的癥狀,該癥狀多在FMT后3天內(nèi)消失。此外,FMT更大的風(fēng)險可能是基于腸道菌群的改變,誘發(fā)慢性病的發(fā)生。目前已知腸道菌群與一些疾病的發(fā)生相關(guān),包括肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化、炎癥性腸病、結(jié)腸癌、非酒精性脂肪肝、腸易激綜合征、哮喘和自閉癥等。改變宿主原有的腸道菌群結(jié)構(gòu),可能增加發(fā)生這些疾病的風(fēng)險。目前還沒有足夠研究來證實FMT的安全性,本研究擬通過小鼠CDAD模型驗證FMT治療艱難梭菌感染的有效性,同時初步探索FMT對宿主行為活動、代謝、免疫等方面的影響,為評價FMT的安全性提供依據(jù)。研究方法和結(jié)果1.構(gòu)建艱難梭菌感染小鼠穩(wěn)定模型,挑選理想的模型動物選擇南方醫(yī)院臨床分離菌株共50株進行復(fù)蘇培養(yǎng),通過觀察菌落形態(tài)、鏡下形態(tài)、乳酸脫氫酶檢測、生化鑒定及毒素檢測等方法鑒定。根據(jù)核糖分型,選擇其中最為常見的作為本研究實驗菌株。選擇C57BL/6、BALB/c、昆明小鼠,3種品系小鼠各24只,按隨機分組原則分為4組(對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組),每組6只。實驗組經(jīng)抗生素誘導(dǎo)后,分別予以不同濃度(108CFU/ml～1010CFU/ml)的臨床分離菌株混懸液灌胃,觀察不同品系小鼠不同時間點腹瀉、全身情況及結(jié)腸組織病理學(xué)變化。1.1.BALB/c小鼠腹瀉癥狀呈細菌濃度依賴性低濃度組(108CFU/mL)中C57BL/6小鼠(n=6)未出現(xiàn)腹瀉；BALB/c小鼠3只出現(xiàn)重度腹瀉癥狀；KM小鼠1只出現(xiàn)輕度腹瀉癥狀。中濃度組(109CFU/mL)中C57BL/6小鼠1只輕度腹瀉；BALB/c小鼠5只出現(xiàn)重度腹瀉癥狀,濕尾范圍較其低濃度組稍大；KM小鼠4只出現(xiàn)不同程度腹瀉,其中1只死亡,至觀察終點存活率為83.3%。高濃度組(1010CFU/mL)中C57BL/6小鼠3只出現(xiàn)重度腹瀉；BALB/c小鼠6只均出現(xiàn)腹瀉,1只小鼠死亡,至觀察終點存活率為83.3%；KM小鼠4只出現(xiàn)腹瀉癥狀,未發(fā)現(xiàn)死亡。感染后小鼠平均體重下降明顯,同時觀察到小鼠活動度下降,毛發(fā)脫落,嚴重者出現(xiàn)弓背。1.2.腹瀉小鼠糞便中分離出艱難梭菌隨機選取3種腹瀉小鼠糞便涂片、染色,可見不同程度腸道菌群失調(diào)及革蘭陽性粗大芽孢桿菌。將腹瀉小鼠糞便或腸內(nèi)容物接種至CCFA-HT培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)并分純,可見艱難梭菌典型菌落形態(tài)。核型分析證實小鼠糞便分離菌株核型與實驗菌株一致。1.3.結(jié)腸病理評分與癥狀嚴重程度相關(guān)健康對照組0分,低濃度組中C57BL/6小鼠為0.3±0.5、BABL/c小鼠為1.5±0.5、KM小鼠為0.7±0.5,中濃度組中C57BL/6小鼠為0.7±0.5、BABL/c小鼠為2.0±0.9、KM小鼠為1.8±1.7,高濃度組中C57BL/6小鼠為1.0±0.6、BABL/c小鼠為3.2±1.2、KM小鼠為1.8±1.0。2.糞菌移植治療小鼠艱難梭菌感染BALB/c小鼠共60只,按隨機分組原則分為4組,每組15只。根據(jù)不同處理分為空白對照組、灌菌組、單次FMT組、3次FMT組,在3個時間點(FMT后1天、FMT后1周、FMT后1月)每組分別處死5只。建模前及每次處死前進行曠場實驗。2.1.FMT治療組腹瀉小鼠減少,未出現(xiàn)死亡感染后,灌菌組小鼠5只出現(xiàn)輕度腹瀉,10只出現(xiàn)重度腹瀉,其中2只于灌菌后第3天死亡；單次FMT組小鼠5只出現(xiàn)輕度腹瀉,無死亡；3次FMT組小鼠僅3只出現(xiàn)輕度腹瀉。2.2.FMT能減輕小鼠腸道炎癥2.2.1.抑制感染小鼠結(jié)腸縮短：灌菌組小鼠結(jié)腸長度縮短,腸腔充血、水腫。感染后第2天,灌菌組小鼠的結(jié)腸長度(8.5±0.46cm)顯著低于空白組小鼠(10.9±0.30cm,p0.01)、單次FMT組小鼠(9.5±0.64cm,p0.01)及3次FMT組小鼠(10.1±0.72cm,p0.01)。感染后第8天,灌菌組小鼠的結(jié)腸長度(8.4±0.24cm)仍顯著低于空白組小鼠(11.5±0.41cm,p0.01)、單次FMT組小鼠(9.8±0.48cm,p0.01)及3次FMT組小鼠(10.5±0.73cm,p0.01)。2.2.2.改善病變腸道炎癥反應(yīng)：灌菌組重度腹瀉小鼠(d2),整個黏膜下層甚至固有層均可見炎性細胞,黏膜下層水腫且伴有上皮細胞的中斷及脫落,腸腔內(nèi)可見偽膜。FMT治療后小鼠腸道可見部分被覆上皮脫落,鄰近黏膜正常,黏膜下層可見少量炎性細胞,腸道炎癥較灌菌組明顯減輕。2.2.3.抑制腸道炎性細胞因子表達：治療后1天,FMT組小鼠腸道不同炎性細胞因子表達量均較灌菌組明顯降低(IL-1β(p0.001)、IL-6(p0.01)、TNF-α(p0.05)),2個FMT組間無明顯差異。治療后7天,各組炎性細胞因子表達量均較治療后1天下降,FMT組仍較灌菌組明顯降低(IL-1β(p0.001)、IL-6(p0.01)、TNF-α(p0.05))。治療后1月,各組炎性細胞因子表達量無明顯差異(p0.05)。2.3.治療后FMT組小鼠自主活動較空白對照組減少,焦慮水平無明顯差異每只小鼠在實驗開始前、實驗終點2個時間點分別進行曠場實驗。實驗開始前,各組小鼠自主活動、焦慮水平無差異(p0.05)；FMT治療后1天,單次FMT組小鼠總運動路程、運動時間、邊緣區(qū)路程、中央?yún)^(qū)路程較空白對照組減少(p0.05)；治療后1月,3次FMT組小鼠總運動路程(p0.01)、運動時間(p0.05)、邊緣路程(p0.01)較空白對照組減少,單次FMT組小鼠總運動路程(p0.05)較空白對照組減少。2.4.治療后各組代謝水平無明顯差異FMT治療后1天、7天、1月,FMT組小鼠血糖、甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等指標較空白對照組、灌菌組均無明顯差異(P0.05))。結(jié)論1.以BALB/c小鼠為對象,予慶大霉素、甲硝唑、多粘菌素、萬古霉素、卡那霉素混合抗生素溶液連續(xù)灌胃9天+克林霉素腹腔注射做預(yù)處理,24h后予10100CFU/ml細菌混懸液灌胃即可成功建立穩(wěn)定的具有臨床代表性的小鼠CDAD模型；2.治療小鼠艱難梭菌感染時,增加糞菌移植次數(shù)未能明顯增加療效；3.糞菌移植治療對小鼠行為活動、代謝水平無明顯長期不良影響,可認為是一項安全有效的治療手段。
【關(guān)鍵詞】：艱難梭菌感染 小鼠模型 糞菌移植 不良反應(yīng) 曠場實驗
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378.8
【目錄】：