本文關(guān)鍵詞：乙肝表面抗體親和力成熟的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：乙型肝炎作為全球十大致死性疾病之一，嚴(yán)重影響人類的生命健康。現(xiàn)階段對于乙型肝炎來說還是預(yù)防為主，各類抗病毒藥物的應(yīng)用并沒有取得令人滿意的效果。但是，抗乙型肝炎病毒抗體的出現(xiàn)對乙型肝炎產(chǎn)生有效的防治作用，為乙型肝炎的防治帶來新的希望。隨著基因工程技術(shù)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的飛速發(fā)展，對抗體的研究和應(yīng)用起到了巨大的推進(jìn)作用。通過基因工程技術(shù)改造的抗體雖然具有較好的特異性，但是操作繁瑣，工作量大。結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展有效的彌補(bǔ)了基因工程技術(shù)在抗體改造中的不足，可以通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)對基因工程抗體的親和力進(jìn)行計(jì)算，減少突變抗體的數(shù)量，并進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。 本課題通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)對已獲得的乙肝表面抗體親和力進(jìn)行優(yōu)化，并通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對其親和力進(jìn)行驗(yàn)證。我們首先利用生物信息學(xué)方法研究了乙肝病毒表面抗原M（Middle Hepatitis B SurfaceAntigen, MHBsAg）和目標(biāo)抗體的序列特征，并從已有的數(shù)據(jù)庫中分別找到了與之同源性較高、質(zhì)量比較好的晶體結(jié)構(gòu)。接著，利用同源模建技術(shù)以晶體結(jié)構(gòu)1WZ4為模板構(gòu)建了目標(biāo)病毒MHBsAg表位的三維結(jié)構(gòu)，以晶體結(jié)構(gòu)4JDT中的H鏈和晶體結(jié)構(gòu)4KMT中L鏈為模板同源模建了目標(biāo)抗體的重鏈和輕鏈，參考晶體結(jié)構(gòu)1F11中抗體輕鏈和重鏈的組裝方式構(gòu)建了目標(biāo)抗體的三維結(jié)構(gòu)。然后，利用分子力學(xué)技術(shù)，先后通過最陡下降法和共軛沉降法兩步對預(yù)測得到的MHBs Ag表位和抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了適度優(yōu)化。接著，通過分子對接技術(shù)將優(yōu)化后的MHBsAg表位與目標(biāo)抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)分子對接，優(yōu)選出了目標(biāo)病毒MHBsAg表位與目標(biāo)抗體的較好的結(jié)合方式。該結(jié)合模式中MHBs Ag表位的一個(gè)螺旋部分鑲嵌在輕、重兩條鏈的loop區(qū)中間，MHBsAg的兩個(gè)螺旋所形成的角度也盡可能多地把重鏈的CDR3區(qū)包住，增大了抗原 抗體之間的相互作用，增強(qiáng)了抗體對抗原的識別，這些與之前的文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果相符合。 在對抗原 抗體復(fù)合物進(jìn)行了適度優(yōu)化之后，，我們對二者之間的相互作用進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。在這個(gè)結(jié)合狀態(tài)中，MHBs Ag能夠很好的嵌入到抗體復(fù)合物輕鏈和重鏈CDR3區(qū)形成的凹槽中間，并與之進(jìn)行充分地接觸，在二者之間共產(chǎn)生了8個(gè)氫鍵相互作用，1個(gè)鹽橋相互作用和1個(gè)陽離子 π相互作用。在氫鍵相互作用中，抗體輕鏈參與的氨基酸主要有兩個(gè)，Arg30和Tyr32，重鏈參與的氨基酸主要有4個(gè)，Tyr32、Arg98、Gln108和Tyr109，而MHBsAg表位參與的氨基酸有8個(gè)，Asn1、Ser2、Gln4、Phe5、His6、Tyr18、Gly22和Gly23。以這些相互作用為線索，對抗體輕鏈上的Arg30，Ala50和重鏈上的Arg98進(jìn)行飽和突變，通過計(jì)算獲得了突變前后的自由能變化圖譜。將這三個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合突變?yōu)榻Y(jié)合能最大的氨基酸殘基，構(gòu)建抗體突變體并誘導(dǎo)表達(dá)，對其活性鑒定發(fā)現(xiàn)聯(lián)合突變體的親和力明顯高于未經(jīng)過結(jié)構(gòu)優(yōu)化的抗體。 綜上所述，本課題通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對乙型肝炎表面抗體結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，并且通過生物學(xué)方法證明經(jīng)過結(jié)構(gòu)優(yōu)化的抗體親和力確實(shí)得到了明顯的提升。為全人源化乙型肝炎表面抗體的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎抗體 親和力成熟 結(jié)構(gòu)生物學(xué) 同源模建法 分子對接法
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 中英文縮略詞11-12
• 第1章 緒論12-25
• 1.1 抗體的研究進(jìn)展12-19
• 1.1.1 抗體的結(jié)構(gòu)和功能12-13
• 1.1.2 抗體的發(fā)展歷程13-16
• 1.1.3 抗體在疾病治療中的應(yīng)用16-19
• 1.2 乙型肝炎免疫治療的研究進(jìn)展19-21
• 1.3 結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究進(jìn)展21-23
• 1.3.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測21-22
• 1.3.2 計(jì)算機(jī)模擬的分子對接技術(shù)22
• 1.3.3 結(jié)構(gòu)生物學(xué)對抗體工程的影響22-23
• 1.4 立題依據(jù)23-25
• 第2章 乙肝表面抗體親和力成熟的實(shí)驗(yàn)研究25-47
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器25
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 2.1.3 引物26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-33
• 2.2.1 利用 Discovery Studio 計(jì)算機(jī)模擬平臺對乙肝表面抗體進(jìn)行改造和優(yōu)化26-27
• 2.2.2 高親和力抗體突變體重組表達(dá)載體的構(gòu)建27-29
• 2.2.3 重組抗體在酵母中的表達(dá)和親和力鑒定29-33
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-44
• 2.3.1 乙型肝炎表面抗體結(jié)構(gòu)模擬突變，初步分析及序列選擇33-34
• 2.3.2 以 1WZ4 為模板，利用同源模建的方法構(gòu)建序列已知的MHBs Ag 的 123 145 位氨基酸結(jié)構(gòu)34-35
• 2.3.3 利用同源模建的方法構(gòu)建抗體結(jié)構(gòu)35-36
• 2.3.4 利用能量最小化對構(gòu)建得到的 MHBs Ag 以及抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行充分優(yōu)化36-37
• 2.3.5 預(yù)測目標(biāo)病毒 MHBs Ag 與抗體 CDR 區(qū)可能的相互作用模式37
• 2.3.6 目標(biāo)病毒 MHBs Ag 抗體的相互作用模式進(jìn)行優(yōu)選37-38
• 2.3.7 利用能量最小化對該相互作用模式進(jìn)行充分優(yōu)化38-39
• 2.3.8 分析相互作用模式特征，找到參與相互作用的關(guān)鍵氨基酸39-41
• 2.3.9 關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)飽和突變后對抗體結(jié)合能力的影響41-42
• 2.3.10 重鏈及輕鏈抗體突變體重組表達(dá)載體的構(gòu)建42
• 2.3.11 輕鏈抗體轉(zhuǎn)化酵母的基因鑒定42-43
• 2.3.12 完整抗體突變體轉(zhuǎn)化酵母的基因鑒定43
• 2.3.13 重組抗體突變體親和活性的變化43-44
• 2.4 討論44-47
• 第3章 研究總結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 作者簡介54-55
• 致謝55

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 ;Recombinant anti-HBsAg Fab blocks hepatitis B virus infection after orthotopic liver transplantation[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2007年04期

2 Zhi-Jian Lu;Su-Jun Deng;Da-Gang Huang;Yun He;Ming Lei;Li Zhou;Pei Jin;;Frontier of therapeutic antibody discovery:The challenges and how to face them[J];World Journal of Biological Chemistry;2012年12期

本文編號：886780