發(fā)布時間：2017-09-16 20:41

  本文關鍵詞：雙靶向調(diào)控CDX2基因慢病毒表達載體的構建及鑒定

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【摘要】：目的構建5個拷貝的HRE和hTERTp雙靶向調(diào)控表達CDX2基因的慢病毒表達載體,并在結腸癌LoVo細胞中檢測其啟動活性。方法設計引物應用PCR法從人結腸癌基因組中克隆獲得hTERT啟動子,用雙酶切和PCR法切除筆者所在課題組已構建的載體pLEGFP-5HRE-CEAp中的CEA啟動子后,將hTERT啟動子與該載體重組,構建出pLEGFP-5HRE-hTERTp;提取5HRE-hTERTp基因序列,同時雙酶切切除pLVX-EGFP-3FLAG載體中的CMV啟動子,同源重組構建獲得pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG載體。設計引物應用PCR法從筆者所在課題組已構建的GV230-CDX2-EGFP載體中克隆獲得CDX2基因序列,用雙酶切和PCR法切除載體pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG中的EGFP后,將CDX2基因序列與該載體重組,構建出pLVX-5HREhTERTp-CDX2-3FLAG。應用pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG載體瞬時轉染體外培養(yǎng)的人結腸癌LoVo細胞,通過觀察綠色熒光蛋白EGFP的表達,鑒定hTERTp的啟動活性。結果經(jīng)PCR和測序分析,pLEGFP-5HREhTERTp、pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG和pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG 3組質(zhì)粒與設計一致,測序正確。將pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG載體瞬時轉染體外培養(yǎng)的人結腸癌LoVo細胞,有綠色熒光表達,提示hTERT啟動子能夠有效啟動下游基因的表達。結論成功構建了pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG及pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG載體,為后續(xù)的體外和體內(nèi)研究打下了基礎。
【作者單位】： 西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外科;西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院普通外科;陜西省人民醫(yī)院麻醉科;
【關鍵詞】： 缺氧 端粒酶 慢病毒載體 基因治療 結直腸癌
【基金】：國家自然科學基金資助項目(項目編號:81101874;項目編號:81172362) 陜西省科學技術研究發(fā)展計劃項目(項目編號:2011-K12-19) 陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(項目編號:2013KTCQ03-08)~~
【分類號】：R346
【正文快照】： 結直腸癌是世界范圍內(nèi)的高發(fā)腫瘤,其死亡率在惡性腫瘤中排第3位[1-2]。在我國,結直腸癌為發(fā)病率第3高的惡性腫瘤,死亡率居第4位[3]。一直以來,以手術為主的綜合治療是結直腸癌治療的首要措施,近年來,隨著基因治療的發(fā)展,為結直腸癌的治療增添了新的方法[4-6],改善了預后,但與

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本文編號：865331