本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲鈣蛋白酶基因的原核表達(dá)及功能分析

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【摘要】：目的克隆表達(dá)日本血吸蟲鈣蛋白酶(Sjcalpain),了解Sjcalpain在尾蚴內(nèi)的分布及其在尾蚴侵染中的作用。方法根據(jù)SjCalpain基因全序列(GenBank登錄號為AB016726)設(shè)計引物,PCR分別擴(kuò)增Sjcalpain的催化位點區(qū)域和Ca2+結(jié)合位點區(qū)域的基因片段,克隆入pET-28a原核表達(dá)載體,并在大腸埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá),組氨酸標(biāo)簽親和層析法純化表達(dá)產(chǎn)物。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白表達(dá)和純化情況。純化的重組蛋白免疫新西蘭白兔制備兔多克隆抗體,ELISA和蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分別檢測多克隆抗體的效價和特異性。利用免疫熒光定位技術(shù)觀察Sjcalpain在尾蚴組織中的分布情況。將尾蚴和鈣蛋白酶抑制劑孵育后感染小鼠,計算血吸蟲減蟲率。結(jié)果成功構(gòu)建了Sjcalpain的催化位點/pET-28a和Ca2+結(jié)合位點/pET-28a原核表達(dá)重組質(zhì)粒,在E.coli BL21(DE3)中成功表達(dá)目的蛋白,相對分子質(zhì)量(Mr)約為43 000和39 000,與預(yù)期大小一致,且均為包涵體表達(dá)。組氨酸標(biāo)簽親和層析成功純化得到目的重組蛋白。間接ELISA結(jié)果顯示,多克隆抗體的效價超過1∶80 000。免疫定位結(jié)果顯示,Sjcalpain在日本血吸蟲尾蚴頭部分布較多。尾蚴侵染抑制實驗中,鈣蛋白酶抑制劑作用組平均獲蟲19條,對照組平均獲蟲23條,減蟲率為17.4%。結(jié)論 Sjcalpain蛋白產(chǎn)物主要分布在日本血吸蟲尾蚴的頭部;Sjcalpain被抑制后可以減少入侵宿主的尾蚴數(shù)量,說明Sjcalpain在尾蚴感染宿主皮膚過程中發(fā)揮一定的作用。
【作者單位】： 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物與微生物工程系;中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所 衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點實驗室 世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲病和絲蟲病合作中心;
【關(guān)鍵詞】： 日本血吸蟲 尾蚴 鈣蛋白酶 免疫定位 侵染
【基金】：國家自然科學(xué)基金(No.81271867) 上海市自然科學(xué)基金(No.13ZR1462800)~~
【分類號】：R383.24
【正文快照】： 日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)以尾蚴的形式入侵終宿主,完成整個生命周期。尾蚴分泌的蛋白酶在侵染過程中發(fā)揮主要作用,因此研究尾蚴分泌的蛋白酶的作用成為研究血吸蟲侵染分子機(jī)制的熱點[1-7]。鈣蛋白酶(calpain)是一種分布較廣的蛋白,常見于多種生物組織中,并發(fā)揮重要

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 黃成玉;盧艷;王瑋;鞠川;馮正;楊忠;王升躍;胡薇;;日本血吸蟲彈性蛋白酶基因的克隆、表達(dá)及蟲期特異性轉(zhuǎn)錄[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2007年05期

2 汪世平;陳秀春;高冬梅;;我國血吸蟲疫苗研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2009年05期

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本文編號：818206