本文關(guān)鍵詞：GP73參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的脂質(zhì)代謝紊亂的機制研究

  更多相關(guān)文章： GP73 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 脂質(zhì)代謝 SCAP SREBPs

【摘要】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡時的狀態(tài)。許多因素都可以導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,包括細(xì)胞內(nèi)未折疊蛋白增多、鈣代謝紊亂、缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激、化學(xué)物質(zhì)處理、卵磷脂合成障礙等,其中未折疊蛋白增多是最常見也最重要的一種因素。未折疊蛋白增多能夠激活細(xì)胞啟動未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response,UPR),UPR可以通過減少蛋白的合成、加速蛋白的降解、增強蛋白的折疊或者增加脂質(zhì)的合成來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。已經(jīng)有大量文獻報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與脂代謝異常類疾病的發(fā)生相關(guān),如非酒精性脂肪肝病(Non alcoholic fatty liver disease,NAFLD),然而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在脂代謝異常中所起的作用尚不清楚,但已經(jīng)明確的是固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白質(zhì)(sterol regulatory element binding proteins,SREBPs)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。SREBPs是一種重要的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。正常情況下,沒有活性的前體SREBPs與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavage activating protein,SCAP)結(jié)合,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)固醇含量減少時,SREBPs/SCAP復(fù)合體轉(zhuǎn)移至高爾基體,在高爾基體被site 1蛋白酶(S1P)與site 2金屬酶(S2P)切割后,它的活性端將釋放進入細(xì)胞核,促進脂質(zhì)合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性;當(dāng)細(xì)胞中固醇水平較高時,胰島素誘導(dǎo)基因(insulin induced gene proteins,Insig)則與SCAP/SREBPs發(fā)生相互作用,抑制SREBPs向高爾基體的轉(zhuǎn)運及活性形式的形成。高爾基體糖蛋白73(Golgi Protein 73,GP73)又叫GOLM1(golgi membrane protein 1)或者GOLPH2(golgi phosphoprotein 2),是一種定位于高爾基體的Ⅱ型跨膜糖蛋白。GP73在人體正常肝組織的肝細(xì)胞中表達(dá)很少甚至不表達(dá),但近幾5年發(fā)現(xiàn)在很多肝臟疾病中其表達(dá)上調(diào)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)GP73能夠誘發(fā)膽固醇相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),而且GP73能與SCAP及SREBPs發(fā)生相互作用,推測GP73很有可能通過SCAP/SREBPs促進脂質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá),參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的SREBPs脂質(zhì)代謝通路。在本研究中,通過體內(nèi)外模型的構(gòu)建以及相關(guān)指標(biāo)的檢測發(fā)現(xiàn):1.GP73可以通過參與SCAP SREBPs脂代謝通路調(diào)控脂質(zhì)代謝:我們在Hep G2細(xì)胞中利用IP、WB技術(shù)檢測了GP73與SCAP及SREBP1的相關(guān)性,免疫熒光檢測了SCAP在細(xì)胞內(nèi)的定位,q PCR技術(shù)檢測脂代謝相關(guān)基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)(1)GP73能夠與SCAP及SREBP1發(fā)生相互作用;(2)過表達(dá)GP73可以增強SCAP、SREBPs的表達(dá);(3)GP73能夠促進SCAP在高爾基體的定位以及SCAP與SREBPs的相互作用;(4)過表達(dá)GP73能上調(diào)脂代謝相關(guān)基因基因的表達(dá),如acety Co A、FASN、HMGCS1、HMGCS2、HMGR。2.GP73在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 SCAP/SREBP1脂質(zhì)代謝通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用:我們用衣霉素(tunicamycin,Tm)、毒胡蘿卜素(Thapsigargin,Tg)、H2O2、Cu SO4分別刺激細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對GP73表達(dá)的影響;最后利用RNAi技術(shù)將細(xì)胞內(nèi)GP73敲低,再檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后SCAP及SREBP1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)(1)藥物刺激產(chǎn)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對GP73的表達(dá)有促進作用;(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對SCAP及SREBP1的表達(dá)具有促進作用;(3)在GP73敲低細(xì)胞內(nèi),利用藥物激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后,SCAP、SREBP1表達(dá)增加不顯著。3.體內(nèi)實驗驗證GP73對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的影響:用藥物Tm以2mg/kg小鼠的用量進行腹腔注射,作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激動物模型,0、8、12、24h后,取小鼠血清及肝臟組織,檢測各項指標(biāo)的變化情況。同時利用RNAi技術(shù)構(gòu)建GP73敲低小鼠,將小鼠分為實驗組及對照組,重復(fù)上述實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(1)肝臟中GP73同C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表達(dá)水平變化一致,隨著藥物作用時間的延長肝臟中GP73同CHOP m RNA逐漸升高,24 h時表達(dá)最高;(2)藥物注射后隨著刺激時間的延長,血清中膽固醇(CH)、甘油三酯(TG)的含量逐漸降低,而肝臟中CH和TG的水平基本呈增高趨勢;(3)藥物Tm刺激后小鼠肝臟中的GP73蓄積增加;(4)在藥物Tm注射12 h后,肝臟組織中GP73m RNA水平表達(dá)明顯增多,且膽固醇、甘油三酯及脂蛋白的水平急劇下降,然而在GP73敲低后可以緩解肝臟中脂質(zhì)的下降水平;小鼠血液中膽固醇、甘油三酯及脂蛋白的水平明顯升高,在GP73敲低小鼠中這種趨勢則被抑制;(5)GP73敲低的小鼠肝臟中,脂質(zhì)累積明顯少于對照組。通過以上研究,我們首次發(fā)現(xiàn)了GP73通過參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路,調(diào)節(jié)了脂質(zhì)代謝,并在固醇調(diào)節(jié)通路中扮演著重要作用。我們的研究證明GP73很有可能就是調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂的關(guān)鍵分子。
【關(guān)鍵詞】：GP73 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 脂質(zhì)代謝 SCAP SREBPs
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R363
【目錄】：

• 縮略詞5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 1 引言11-16
• 1.1 GP73、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及SREBPs的生物學(xué)特性11-13
• 1.2 GP73可能參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路導(dǎo)致肝臟疾病13-14
• 1.3 研究設(shè)想、實驗方法和實際設(shè)計14-15
• 1.4 擬解決的問題、理論意義和實用價值等15-16
• 2 材料與方法16-24
• 2.1 菌株、細(xì)胞株及質(zhì)粒16
• 2.2 分子生物學(xué)工具酶及試劑盒16
• 2.3 載體構(gòu)建（陰影為酶切位點）16
• 2.4 細(xì)胞培養(yǎng)16-17
• 2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染17-18
• 2.6 免疫沉淀18
• 2.7 免疫印跡18-19
• 2.8 酶聯(lián)免疫吸附（GP73 ELISA）19
• 2.9 細(xì)胞中總RNA的提取及RT PCR、合成c NDA19-22
• 2.10 免疫熒光（IF）22
• 2.11 蛋白相互作用試劑olink試驗(PLA)22-23
• 2.12 小鼠體內(nèi)GP73敲低的模型23
• 2.13 小鼠體內(nèi)脂質(zhì)含量的測定23
• 2.14 免疫組化及Oil Red O染色23-24
• 2.15 統(tǒng)計學(xué)分析24
• 3 結(jié)果24-41
• 3.1 GP73通過SCAP/SREBPs造成脂代謝異常24-30
• 3.2 GP73為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中的關(guān)鍵分子30-33
• 3.3 體內(nèi)實驗中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激仍可通過GP73引起脂類代謝異常33-41
• 4 討論41-44
• 4.1 GP73與肝癌發(fā)生的相關(guān)性41
• 4.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-GP73-SCAP/SREBPs-脂質(zhì)代謝紊亂的分子機制解析41-44
• 5 結(jié)論44-45
• 6 參考文獻45-48
• 7 附錄48-49
• 8 致謝49-51
• 9 綜述51-62
• 參考文獻56-62

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 史玉玲;;血清AFP-L3,GP73聯(lián)合檢測對原發(fā)性肝癌早期診斷價值[J];北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2013年05期

2 管楷;黃蓓;鐘輝;;高爾基體膜蛋白GP73小干擾RNA質(zhì)粒的構(gòu)建及穩(wěn)定干擾GP73細(xì)胞株的篩選[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2010年05期

3 顧劍鋒;李明峰;顧樹南;;GP73與肝癌關(guān)系的研究進展[J];肝膽胰外科雜志;2011年06期

4 蔡慶春;;GP73在肝癌與肝硬化鑒別診斷中的臨床價值[J];河南醫(yī)學(xué)研究;2014年04期

5 ;[J];;年期

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉云濤;GP73有望成為肝癌早診斷新指標(biāo)[N];中國醫(yī)藥報;2008年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王翠;GP73參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的脂質(zhì)代謝紊亂的機制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

，

本文編號：814303