本文關(guān)鍵詞：PM2.5對HepG2細(xì)胞脂肪變和凋亡的影響及白藜蘆醇干預(yù)研究

  更多相關(guān)文章： PM2.5 肝細(xì)胞 脂肪變 凋亡 白藜蘆醇

【摘要】：目的：本研究采用HepG2細(xì)胞作為毒性評價模型,觀察廣州城區(qū)PM2.5對肝細(xì)胞脂肪變和凋亡的影響,研究PM2.5對肝細(xì)胞的毒性作用,揭示PM2.5促NAFLD發(fā)生的可能機制,并觀察白藜蘆醇對PM2.5誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的干預(yù)效果,從對肝細(xì)胞的直接影響探討PM2.5引起NAFLD的機制及其中醫(yī)藥防治方法。方法：1)PM2.5對HepG2細(xì)胞脂肪變的影響：采集廣州市區(qū)大氣中的PM2.5,首先用CCK-8法檢測PM2.5刺激對HepG2細(xì)胞的毒性,確定PM2.5的使用濃度,然后觀察PM2.5刺激24h后細(xì)胞內(nèi)脂肪含量的變化。實驗分組為陰性對照組和PM2.5組(PM2.5終濃度分別為6,25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml),采用油紅O染色法觀察HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴變化,并用甘油三酯、總膽固醇試劑盒測定檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集情況；最后用Real-time PCR法檢測各實驗組中HepG2細(xì)胞脂質(zhì)合成關(guān)鍵分子LXRa和SREBP-1c的mRNA表達(dá)情況,初步探討PM2.5作用的信號途徑。2)PM2.5對HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響：實驗分組為陰性對照組和PM2.5組(PM2.5終濃度分別為12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)。采用H2DCF-DA熒光探針法檢測PM2.5刺激4h后各組細(xì)胞胞內(nèi)總ROS含量；采用酶標(biāo)法檢測PM2.5刺激8h后HepG2細(xì)胞內(nèi)總SOD、GSH和MDA含量；運用Real-time PCR法檢測PM2.5刺激4h后HepG2細(xì)胞SOD1、SOD2、GSH和CAT的mRNA表達(dá)情況；采用Annexin V-FITC/PI雙染法以流式細(xì)胞術(shù)檢測PM2.5刺激24h后HepG2細(xì)胞的凋亡情況：采用Western Blot法檢測PM2.5刺激24h后HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Caspase 9和Caspase 3的蛋白表達(dá)量情況。3)白藜蘆醇對PM2.5誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響：用CCK-8法確定白藜蘆醇的安全濃度,根據(jù)結(jié)果實驗分為陰性對照組、PM2.5組(終濃度50μng/ml)和PM2.5+白藜蘆醇組(PM2.5終濃度為50μg/ml,白藜蘆醇終濃度分別為20μmol/l、40μmol/l和80μmol/l)。采用H2DCF-DA熒光探針法觀察白藜蘆醇干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)ROS含量變化；通過酶標(biāo)法檢測白藜蘆醇對PM2.5引起的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響,檢測指標(biāo)包括細(xì)胞內(nèi)SOD含量和MDA含量；運用Real-time PCR檢測白藜蘆醇對HepG2細(xì)胞SOD1、SOD2和CAT的mRNA表達(dá)情況的影響；采用CCK-8法和Annexin V-FITC雙標(biāo)法以流式細(xì)胞術(shù)檢測白藜蘆醇對PM2.5誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用；采用Western Blot法檢測白藜蘆醇對HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Caspase 9和Caspase 3)的影響。結(jié)果：1)PM2.5對HepG2細(xì)胞脂肪變的影響：CCK-8結(jié)果顯示,PM2.5刺激24h后,50μg/ml和100μg/ml PM2.5組的HepG2細(xì)胞存活率較陰性對照組顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；用6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml的PM2.5刺激HepG2細(xì)胞,油紅O染色顯示,PM2.5干預(yù)后HepG2細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴明顯增多,并出現(xiàn)脂滴融合現(xiàn)象；酶標(biāo)法檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量,結(jié)果顯示PM2.5組刺激后細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量明顯升高,與對照組比較有顯著性差異(P0.05),而總膽固醇含量也有升高的趨勢,但與陰性對照組比較差異無顯著性(P0.05); Real-time PCR結(jié)果顯示,PM2.5可以上調(diào)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)合成關(guān)鍵分子LXRα、SREBP-1c mRNA表達(dá),與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),這可能是其使肝細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)含量增多的原因之一。2)PM2.5對HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響：H2DCF-DA熒光探針染色后鏡下觀察結(jié)果顯示,PM2.5干預(yù)后HepG2細(xì)胞內(nèi)熒光強度明顯增大,用酶標(biāo)儀對ROS含量進(jìn)行定量檢測,結(jié)果也證實了細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯升高,且與陰性對照組比較有顯著性差異(P0.01);酶標(biāo)法檢測細(xì)胞內(nèi)SOD.MDA和GSH含量,結(jié)果顯示PM2.5組刺激后細(xì)胞內(nèi)SOD含量明顯降低,與對照組比較有顯著性(P0.01),MDA明顯升高,與對照組比較有顯著性差異(P0.01),但GSH含量與對照組無顯著變化(P0.05); Real-time PCR結(jié)果顯示,PM2.5可以下調(diào)HepG2細(xì)胞的抗氧化酶相關(guān)基因SOD1、SOD2、CAT mRNA表達(dá),與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),而GSHmRNA與對照組比較無明顯變化(P0.05); Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果表明,PM2.5干預(yù)后HepG2細(xì)胞凋亡率明顯增加,與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；Western Blot法結(jié)果顯示,PM2.5可以上調(diào)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cytochrome C、 Caspase 9、Caspase 3蛋白的表達(dá)量與Bax/Bcl-2比值,與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),上述結(jié)果提示通過引起細(xì)胞氧化應(yīng)激從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡可能是PM2.5造成肝細(xì)胞損傷的一個重要途徑。3)白藜蘆醇對PM2.5誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響：CCK-8結(jié)果顯示,白藜蘆醇刺激24h后,0～80μmol/l白藜蘆醇組的HepG2細(xì)胞存活率較陰性對照組無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05); H2DCF-DA熒光探針染色的鏡下觀察結(jié)果顯示,PM2.5+不同濃度白藜蘆醇組HepG2細(xì)胞內(nèi)熒光強度明顯減弱,而用酶標(biāo)儀對ROS含量進(jìn)行定量檢測,結(jié)果也證實了細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯下降,且與PM2.5組比較有顯著性差異(P0.01)；酶標(biāo)法檢測也發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預(yù)后HepG2細(xì)胞內(nèi)SOD含量升高,與PM2.5組比較有顯著性差異顯著(P0.01), MDA含量則明顯降低,與PM2.5組比較差異顯著(P0.01); Real-time PCR結(jié)果顯示白藜蘆醇可以上調(diào)HepG2細(xì)胞的SOD1、SOD2、CAT的mRNA表達(dá),與PM2.5組有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),說明白藜蘆醇可以抑制PM2.5引起HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激；CCK-8法和Annexin V-FITC/PI雙染法檢測白藜蘆醇對PM2.5引起的HepG2細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示白藜蘆醇干預(yù)后HepG2細(xì)胞存活率升高,與PM2.5組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),肝細(xì)胞凋亡率較PM2.5組也有明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01); Western Blot法結(jié)果顯示,白藜蘆醇可以下調(diào)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cytochrome C、Caspase 9 Caspase 3蛋白的表達(dá)量與Bax/Bcl-2比值,與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),說明白藜蘆醇可通過抑制氧化應(yīng)激進(jìn)而減少PM2.5引起HepG2細(xì)胞凋亡,保護(hù)肝細(xì)胞。結(jié)論：1)PM2.5可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變,該過程可能與PM2.5上調(diào)脂質(zhì)合成關(guān)鍵分子LXRa和SREBP-1c mRNA表達(dá)有關(guān)：2)PM2.5可能通過抑制HepG2細(xì)胞的抗氧化能力(下調(diào)SOD1、SOD2和CAT表達(dá))引起細(xì)胞氧化應(yīng)激,進(jìn)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡；3)白藜蘆醇對PM2.5誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡具有改善作用,其保護(hù)機制可能是通過減少PM2.5引起的氧化應(yīng)激而實現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：PM2.5 肝細(xì)胞 脂肪變 凋亡 白藜蘆醇
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 一 前言14-20
• 1 PM的定義、分類及其特性14-15
• 2 PM2.5對人體健康的影響15-16
• 2.1 PM2.5對肺部的損傷15-16
• 2.2 PM2.5對心血管的損傷16
• 2.3 PM2.5對肝臟的損傷16
• 3 NAFLD16-18
• 4 白藜蘆醇與其抗氧化作用18-19
• 5 研究意義19-20
• 二 論文總體技術(shù)路線20-21
• 三 材料與方法21-24
• 1 實驗儀器和材料21-23
• 1.1 實驗儀器21
• 1.2 主要試劑21-23
• 1.3 實驗細(xì)胞23
• 2 主要試劑的配制23-24
• 2.1 白藜蘆醇母液(80mmol/l)23
• 2.2 油紅O染液23-24
• 四 實驗方法和步驟24-36
• 1 PM2.5的采集與處理24-25
• 1.1 采集地點和時間24
• 1.2 灰霾天氣判定24
• 1.3 濾膜前期處理24
• 1.4 采集方法24
• 1.5 PM2.5顆粒的制備24
• 1.6 PM2.5懸浮液的配制24-25
• 2 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)25
• 3 PM2.5對HepG2細(xì)胞脂肪變的影響25-28
• 3.1 油紅O染色檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積情況25
• 3.2 HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇含量的測定25-26
• 3.3 Real-time PCR檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)LXRα、SREBP-1c mRNA的表達(dá)26-28
• 4 PM2.5對HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響28-34
• 4.1 H2DCF-DA染色法測定PM2.5刺激后HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS28-29
• 4.2 PM2.5對HepG2細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA、GSH含量的影響29-32
• 4.3 Real-time PCR檢測PM2.5對HepG2細(xì)胞SOD1、SOD2、GSH、CAT mRNA的影響32-33
• 4.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測PM2.5刺激后的細(xì)胞凋亡率33
• 4.5 Western Blot檢測PM2.5刺激HepG2細(xì)胞后的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)33-34
• 5 白藜蘆醇對PM2.5誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響34-35
• 5.1 CCK-8法檢測白藜蘆醇對HepG2細(xì)胞的毒性34
• 5.2 H2DCF-DA熒光探針法檢測白藜蘆醇干預(yù)后HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS34
• 5.3 HepG2細(xì)胞中SOD、MDA含量的測定34-35
• 5.4 Real-time PCR檢測白藜蘆醇對HepG2細(xì)胞SOD1、SOD2、CAT mRNA的影響35
• 5.5 CCK-8法檢測白藜蘆醇對PM2.5誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用35
• 5.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測白藜蘆醇干預(yù)后的細(xì)胞凋亡率35
• 5.7 Western Blot檢測白藜蘆醇干預(yù)后的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)35
• 6 統(tǒng)計學(xué)分析35-36
• 五 結(jié)果36-51
• 1 PM2.5對HepG2細(xì)胞活性的影響36
• 2 油紅O染色檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)變化36-37
• 3 PM2.5對HepG2細(xì)胞甘油三酯和總膽固醇含量的影響37
• 4 PM2.5對HepG2細(xì)胞LXRα、SREBP-1c mRNA表達(dá)的影響37-38
• 5 PM2.5對HepG2細(xì)胞氧自由基生成的影響38-39
• 6 PM2.5對HepG2細(xì)胞SOD、MDA、GSH含量的影響39-41
• 7 PM2.5對HepG2細(xì)胞SOD1、SOD2、GSH、CAT mRNA表達(dá)的影響41
• 8 PM2.5對HepG2細(xì)胞凋亡的影響41-42
• 9 PM2.5對HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響42-44
• 10 白藜蘆醇對HepG2細(xì)胞的毒性研究44
• 11 白藜蘆醇對PM2.5誘導(dǎo)的ROS生成的影響44-45
• 12 白藜蘆醇對HepG2細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA含量的影響45-46
• 13 白藜蘆醇對HepG2細(xì)胞SOD1、SOD2、CAT mRNA表達(dá)的影響46-47
• 14 白藜蘆醇對PM2.5誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞毒性的保護(hù)作用47-48
• 15 白藜蘆醇對PM2.5誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的影響48
• 16 白藜蘆醇干預(yù)對HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響48-51
• 六 討論51-55
• 1 PM2.5對HepG2細(xì)胞脂肪變的影響及機制52
• 2 PM2.5對HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響52-54
• 3 白藜蘆醇干預(yù)研究54-55
• 七 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-62
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文62-63
• 附錄 英文縮略詞表63-64
• 致謝64

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本文編號：809548