本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用AdEasy-1腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建人GDF-5基因重組腺病毒

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【摘要】：目的應(yīng)用AdEasy-1腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建人生長分化因子-5(GDF-5)基因重組腺病毒載體,并在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增制備重組腺病毒。方法將PCR獲取的GDF-5基因插入到質(zhì)粒pMD19-T中,基因測序鑒定后將目的基因克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV,HindⅢ酶切鑒定。重組質(zhì)粒經(jīng)PmeⅠ酶切使之線性化并去磷酸化處理,電轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的感受態(tài)大腸埃希菌BJ5183,使其在細(xì)菌內(nèi)發(fā)生同源重組,卡那霉素篩選,HindⅢ酶切鑒定陽性克隆,擴(kuò)增重組腺病毒質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,包裝成重組腺病毒Ad-GDF-5,分別采用Western blot、TCID50法對Ad-GDF-5進(jìn)行蛋白鑒定和滴度測定。結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的GDF-5大小約為1.7kb,基因測序結(jié)果證實(shí)該基因與GENBANK中人GDF-5基因序列相同。pShuttle-CMV-GDF-5、pShuttle-CMV-GDF-5-AdEasy-1經(jīng)HindⅢ酶切后均得到大小約為1.7kb的片段,與GDF-5大小相符。Western blot證實(shí)Ad-GDF-5感染HEK293細(xì)胞后大量表達(dá)成熟GDF-5蛋白。研究結(jié)果表明成功地構(gòu)建了攜帶人GDF-5基因的重組腺病毒載體,并制備出5.6×109 PFU/mL的重組腺病毒。結(jié)論利用AdEasy-1腺病毒載體系統(tǒng)成功構(gòu)建了攜帶人GDF-5基因的重組腺病毒載體,并制備出高滴度值的重組腺病毒Ad-GDF-5,為進(jìn)一步研究GDF-5的生物學(xué)功能及其相關(guān)疾病的基因治療奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 南充市中心醫(yī)院;川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院組織工程與干細(xì)胞研究所;
【關(guān)鍵詞】： 腺病毒科 生長分化因子- 基因治療
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81201407、81171472、81071270、30872614) 四川省杰出青年學(xué)科帶頭人資助計(jì)劃(09ZQ026-005) 四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2010SZ0048) 南充市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)資金項(xiàng)目(11A0115) 川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目重點(diǎn)培育項(xiàng)目(CBY11-A-ZP01)
【分類號】：R346
【正文快照】： 生長分化因子-5(GDF-5)亦稱軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白-1(CDMP-1)或骨形態(tài)發(fā)生蛋白-14(BMP-14),是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族-骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)家族中的特殊成員,是骨骼正常發(fā)生和發(fā)育必需的生長因子。GDF-5除了可促進(jìn)軟骨發(fā)生、軟骨成骨、長骨發(fā)育、關(guān)節(jié)形成和修復(fù)骨、軟

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本文編號：761796