本文關(guān)鍵詞：我國華支睪吸蟲中間宿主螺類分子系統(tǒng)發(fā)育研究

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【摘要】：華支睪吸蟲隸屬于后睪科(Opisthorchiidae)的支睪屬(Clonorchis),它寄生于人體肝膽系統(tǒng),可引發(fā)多種疾病,如膽石癥、膽囊炎、膽管炎、膽管癌等。它是一種嚴(yán)重危害人類健康的食源性寄生蟲病。我國為華支睪吸蟲的流行地區(qū),華支睪吸蟲病是我國重點防治的寄生蟲病之一。華支睪吸蟲的生活史復(fù)雜,需要兩個中間宿主(螺和魚蝦)和一個終宿主才能完成整個生活史。華支睪吸蟲生活史中較少有研究是針對于其第一中間宿主螺類。研究中間宿主螺類的分類,對防治華支睪吸蟲病及螺類的生物學(xué)研究等具有實際意義。目前,一些中間宿主螺類有一些相近種類形態(tài)不易區(qū)分,結(jié)合外部形態(tài)及內(nèi)部解剖等形態(tài)學(xué)方法鑒定物種有難度,而運用近幾年新興的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行第一中間宿主螺類的分類研究卻有實際意義。DNA條形碼(DNA barcoding)是一種新興的物種鑒定方法,即從DNA序列上選取一個較短的片段應(yīng)用為快速鑒別種類的標(biāo)記,不同物種的標(biāo)記可與相應(yīng)的物種建立相互對應(yīng)的關(guān)系。這種分子生物學(xué)方法已廣泛應(yīng)用。在本研究中,我們首先驗證了DNA條形碼技術(shù)用于華支睪吸蟲中間宿主種類鑒定的可行性,再利用該技術(shù)對中間宿主螺類進(jìn)行了初步的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的研究。此外,還對廣西橫縣兩種螺是否存在同種異名現(xiàn)象進(jìn)行了探討。具體研究結(jié)果如下：1.對采集于我國華支睪吸蟲第一中間宿主螺類廣泛分布地區(qū)的9種(另外有三個為未知種)共136個個體的線粒體COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測序,共得到9種(另外還有三個未知種)85條COI序列,擴(kuò)增個體的成功率為62.5%。對所得的COI序列分析后,發(fā)現(xiàn)豆螺科內(nèi)所測物種的種內(nèi)平均遺傳距離為1.31%,其中最大的種內(nèi)遺傳距離為14.50%,最小種內(nèi)遺傳距離為0.2%。豆螺科內(nèi)各個種間平均遺傳距離為14.80%,存在條形碼間隙。其他科的螺類,如跑螺科(Thiaridae)的瘤擬黑螺(Melanoides tuberculata)、肋蜷科(Pleuroseridae)的方格短溝蜷(Semisulcospira cancellata)和放逸短溝蜷(Semisulcospira libertind)及擬沼螺未知種(Assimineidae)的平均種內(nèi)遺傳距離小于1%,種間距離為平均種內(nèi)距離的10倍以上,存在條形碼間隙。結(jié)果證明,基于COI序列的DNA條形碼技術(shù)可有效鑒定本研究中的螺類。2.在本研究中,將COI、16S rDNA、ITS-1、28S rDNA四個基因位點合并應(yīng)用于本研究中螺類的系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)16S rDNA的通用引物難以擴(kuò)增大部分實驗樣品,研究中較易擴(kuò)增獲得ITS-1和28S rDNA的DNA條形碼序列。在基于COI序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹中,幾乎所有種類形成單系群,并有較高的支持度。其屬和總科也形成了各自的分支。而基于16S rDNA、ITS-1、28S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分析結(jié)果有較大出入。3.應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)方法鑒別采集于廣西橫縣的硬豆螺(Bithynia robusta)與赤豆螺(Bithynia fuchsiana)。兩種豆螺形態(tài)相似、棲息生境相同,考慮可能存在同種異名現(xiàn)象。通過觀察兩種螺類的外部形態(tài)及測量其主要參數(shù),比較兩種豆螺的雄性生殖系統(tǒng),采用基于COI(Cytochrome c oxidase subunit Ⅰ, COI)基因的DNA條形碼方法進(jìn)行螺種鑒別,并構(gòu)建系統(tǒng)樹。在研究中發(fā)現(xiàn)兩種螺類的個體外形基本一致,并具有形態(tài)相似的雄性生殖系統(tǒng)。兩種螺類的種間距離小,小于3%。COI基因序列的變異較小。序列進(jìn)行整理和剪切后,22個個體的COI基因片段均為517bp,無插入、缺失位點。根據(jù)COI基因序列進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)兩類群的個體明顯聚為一支。根據(jù)本研究的形態(tài)學(xué)和COI基因序列證據(jù),提示采自廣西橫縣的赤豆螺與硬豆螺可能為同種異名。
【關(guān)鍵詞】：華支睪吸蟲 中間宿主 螺 DNA條形碼 系統(tǒng)發(fā)育 分類 鑒定 形態(tài)學(xué)
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R383.22
【目錄】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-21
• 1. DNA條形碼技術(shù)12-16
• 1.1 DNA條形碼方法概述12-13
• 1.1.1 DNA條形碼的相關(guān)概念12
• 1.1.2 DNA條形碼技術(shù)的操作流程12-13
• 1.1.3 DNA條形碼方法的優(yōu)缺點13
• 1.2 DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用13-15
• 1.2.1 DNA條形碼在軟體動物鑒定中的應(yīng)用13-15
• 1.2.2 DNA條形碼在醫(yī)學(xué)貝類研究中的應(yīng)用15
• 1.3 DNA條形碼方法在貝類研究中的前景及展望15-16
• 2. 分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)16-18
• 2.1 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的發(fā)展16
• 2.2 基本概念16-17
• 2.3 一般研究方法17-18
• 3. 華支睪吸蟲第一中間宿主概況18-19
• 3.1 中間宿主螺類概述18-19
• 3.1.1 豆螺科概述18-19
• 3.1.2 肋蜷科概述19
• 3.1.3 跑螺科概述19
• 3.1.4 擬沼螺科概述19
• 4. 本研究的立題依據(jù)、研究內(nèi)容及目的19-21
• 第一部分 我國華支睪吸蟲第一中間宿主螺類DNA條形碼研究21-35
• 1. 引言21
• 2. 材料與方法21-25
• 2.1 樣品采集21-22
• 2.2 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果22-23
• 2.3 DNA條形碼實驗23-25
• 3. 實驗結(jié)果25-32
• 3.1 形態(tài)鑒定結(jié)果25-27
• 3.2 DNA條形碼COI擴(kuò)增結(jié)果27
• 3.3 序列特征分析27-28
• 3.4 遺傳距離與鄰接樹分析28-32
• 4. 討論32-34
• 4.1 本研究中螺類形態(tài)的多樣性32
• 4.2 COI基因引物有效性32-33
• 4.3 COI基因在螺類鑒定中的有效性分析33-34
• 5. 總結(jié)34-35
• 第二部分 我國華支睪吸蟲第一中間宿主螺類系統(tǒng)發(fā)育研究35-48
• 1. 引言35-36
• 2. 材料與方法36-37
• 2.1 實驗材料36
• 2.2 實驗方法36
• 2.3 PCR擴(kuò)增及測序36-37
• 3 結(jié)果37-45
• 3.1 COI序列37-38
• 3.2 16S rDNA序列38-40
• 3.3 ITS-1序列40-42
• 3.4 28S rDNA序列42-45
• 4. 討論45-47
• 4.1 COI和16S rDNA基因用于分子系統(tǒng)學(xué)研究的有效性45-46
• 4.2 ITS-1基因應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育研究的有效性46
• 4.3 28S rDNA基因應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育研究的有效性46-47
• 5. 總結(jié)47-48
• 第三部分 應(yīng)用形態(tài)學(xué)及DNA條形碼技術(shù)鑒別廣西橫縣地區(qū)兩種豆螺48-58
• 1. 引言48
• 2. 材料與方法48-50
• 2.1 材料49
• 2.2 外部形態(tài)參數(shù)比較49
• 2.3 生殖系統(tǒng)解剖49
• 2.4 DNA提取及PCR擴(kuò)增49
• 2.5 數(shù)據(jù)分析49-50
• 3. 實驗結(jié)果50-56
• 3.1 貝殼形態(tài)50-51
• 3.2 生殖系統(tǒng)解剖結(jié)果51-52
• 3.3 DNA序列分析及遺傳距離分析52-53
• 3.4 系統(tǒng)學(xué)分析53-56
• 4 討論56-58
• 研究總結(jié)58-60
• 1. 主要研究結(jié)果58
• 2. 創(chuàng)新點58
• 3. 不足與展望58-60
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 致謝63-65
• 發(fā)表文章65-66
• 附錄一66-70
• 附錄二70-74

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8 鐘睿，

本文編號：729875